量子ドットを用いたシナプス間隙における膜蛋白質動態解析

• Project/Area Number: 16650075
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Nerve anatomy/Neuropathology
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 岡部 繁男 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60204012)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2005: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2004: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
• Keywords: 蛍光顕微鏡法 / 一分子イメージング / グルタミン酸受容体 / シナプス

Research Abstract

ストレプトアビジン結合量子ドットを利用して、ビオチン標識した細胞膜表面抗原に対する抗体による生細胞の染色を行う事で、生きた神経細胞の表面での膜蛋白質の動態を追跡した。初代培養海馬神経細胞に組み換えアデノウィルスを用いてペプチドタグの付加されたNMDA受容体を発現させ、量子ドットを利用して膜表面でのNMDA受容体の検出を行った。蛍光シグナルは海馬神経細胞の樹状突起に観察されたので、更に量子ドットの分布をシナプス前部および後部構造のマーカーであるsynapsin I、PSD-95の抗体染色像と比較した。量子ドット由来のシグナルは、シナプス前部および後部構造のマーカーと一部重なって観察されたが、シナプス外領域に存在する量子ドットのシグナルがシナプス内に存在するシグナルより総和としては大きくなった。この結果は内在性のNMDA受容体全体の分布とは異なっており、可能性として細胞膜表面でのNMDA受容体の局在はシナプス部位よりもシナプス外領域に優位である事が考えられた。内在性のNMDA受容体を染色する抗体では細胞表面の分子を選択的にラベルする事が不可能であったので、細胞外ドメインにmycタグの付加されたNR1サブユニットについて、量子ドットとAlexa色素による染色パターンを比較した。両者の染色パターンは良く一致しており、利用した蛍光タグの相違で内在性の蛋白質との分布の違いが生じたのではない事が分かった。しかしながら量子ドット一分子の蛍光シグナルの細胞膜上での動態は、Alexa一分子の動きに比較して遅く、量子ドットを利用した場合には膜上受容体のクラスタリングが引き起こされている可能性が示唆された。量子ドットに対する抗体の結合比率を検討する事で、クラスタリングが引き起こされない実験条件を選択する事が必要である事がわかった。

Research Products

• [Journal Article] Bi-directional regulation of postsynaptic cortactin distribution by BDNF and NMDA receptor activity (2005)
  • Author(s): Iki, J., Inoue, A., Bito, H., S.Okabe
  • Journal Title: European Journal of Neuroscience 22 Pages: 2985-2994
• [Journal Article] Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. (2005)
  • Author(s): Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., S.Okabe
  • Journal Title: Nature Methods 2 Pages: 677-684
• [Journal Article] The RNA-binding protein TLS is translocated to dendritic spines by mGluR5 activation and regulates spine morphology. (2005)
  • Author(s): Fujii, R.^*, Okabe, S.^*, Urushido, T., Inoue, K., Yoshimura, A., Tachibana, T., Nishikawa, T., Hick, G.G., T.Takumi, ^*equal contribution
  • Journal Title: Current Biology 15 Pages: 587-593
• [Journal Article] High-purity lineage selection of embryonic stem cell-derived neurons. (2005)
  • Author(s): Schmandt, T., Meents, E., Gossrau, G., Gornik, V., Okabe, S., O.Brustle
  • Journal Title: Stem Cells and Development 14 Pages: 55-64
• [Journal Article] Direct visualization of cell movement in the embryonic olfactory bulb using green fluorescent protein transgenic mice : evidence for rapid tangential migration of neural cell precursors. (2005)
  • Author(s): Yamamoto, K., Yamaguchi, M., S.Okabe
  • Journal Title: Neuroscience Research 51 Pages: 199-214
  • NAID: 10015450997
• [Journal Article] Simultaneous observation of stably associated presynaptic varicosities and postsynaptic spines : morphological alterations of CA3-CA1 synapses in hippocampal slice cultures. (2005)
  • Author(s): Umeda, T., Ebihara, T., S.Okabe
  • Journal Title: Molecular and Cellular Neuroscience 28 Pages: 264-274
• [Journal Article] Simultaneous Observation of Stably Associated Presynaptic Varicosities and Postsynaptic Spines : Morphological Alterations of CA3-CA1 Synapses in Hippocampal mice Cultures. (2005)
  • Author(s): Umeda, T., Ebihara, T., S.Okabe
  • Journal Title: Molecular and Cellular Neuroscience 28 Pages: 264-274
• [Journal Article] Electroporation-mediated gene transfer system applied to cultured CNS neurons (2004)
  • Author(s): Kawabata, I., Umeda, T., Yamamoto, K., S.Okabe
  • Journal Title: Neuroreport 15 Pages: 971-976
• [Journal Article] Telencephalin slows spine maturation.
  • Author(s): Matsuno, H., Okabe, S., Mishina, M., Yanagida, T., Mori, K., Y.Yoshihara
  • Journal Title: Journal of Neuroscience in press
• [Journal Article] The RNA binding protein TLS is translocated to dendritic spines by mGluR5 activation and regulates spine morphology.
  • Author(s): Fujii, R.^*, Okabe, S.^*, Urushido, T., Inoue, K., Tachibana, T., Nishikawa, T., Hick, G.G., T.Takumi
  • Journal Title: Current Biology (in press)