ニワトリB細胞株を用いたヒトDNA修復遺伝子のSNPの機能評価

• Project/Area Number: 16651100
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied genomics
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 松田 文彦 京都大学, 医学研究科, 教授 (50212220)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 園田 英一朗 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50281093)
• Project Period (FY): 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2004: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
• Keywords: DNA修復遺伝子 / 一塩基多型 / 機能評価 / DT40細胞 / XRCC2 / Rad51 / ガンマ線照射 / シスプラチン

Research Abstract

ヒト遺伝子のSNP解析で得られた情報は、個々のSNPの機能評価の裏付けがあって初めて生物学的意味を持つ。現在までに膨大な数のSNPが同定されているが、遺伝子のコーディング領域に存在するSNPと遺伝子産物の構造や機能の変化、すなわち質的影響に関してはほとんど解析されていない。本研究では、SNPが遺伝子機能に与える質的影響について、SNPをもつDNA修復遺伝子の機能を細胞レベルで容易に判定できるニワトリDT40細胞株を用いて、ヒトDNA修復遺伝子Rad51、XRCC2について調べた。
DT40細胞株の外来DNA断片を導入した時極めて高頻度に相同組換えを起こす性質を利用して、ニワトリRad51、XRCC2を破壊した変異細胞株に、それぞれヒトRad51、XRCC2のアミノ酸変異を伴う一塩基多型を含むcDNAと野生型のcDNAを細胞に導入した。ヒト遺伝子の発現を確認した後、それぞれの細胞株の放射線或はシスプラチンに対する感受性を、生存する細胞数を指標に比較した。
Rad51に関しては、野生型、変異型cDNAを導入し、安定に発現する細胞株を数株づつ樹立した。ガンマ線照射、シスプラチン処理の両法を用いてSNPの遺伝子機能に対する影響を調べたが、特に大きな差は見られなかった。XRCC2も同様にヒト遺伝子を安定して発現する細胞株を数株づつ樹立し、Rad51と同様に、ガンマ線照射、シスプラチン処理を行った。ガンマ線照射では野生型、変異型の間に大きな差は見られなかった。これはXRCC2はガンマ線によるDNAダメージの修復には深く関わっていないという報告と一致していた。一方シスプラチン処理では、変異型細胞株が野生型に対して約2倍感受性が高い結果が、第一回目のアッセイで得られた。現在、細胞株の数を増やして再現性の確認を行っている
この系を用いるとSNPを持つヒトDNA修復遺伝子の機能を迅速に決定でき、多型・変異遺伝子の機能評価の方法として、最も感度がよく信頼性のある方法である。現在さらに遺伝子数を増やして、系統的にヒトSNPの機能評価を進めている。