| Project/Area Number |
16657033
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Field |
Functional biochemistry
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
今川 敏明 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (20142177)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2004 – 2005
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
|
| Budget Amount *help |
¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
|
|---|
| Keywords | Na / K-ATPase / 無細胞たんぱく質合成 / 膜タンパク質 / P型ATPase / イオン輸送 / タンパク質間相互作用 / エネルギー変換 / 蛍光タンパク質 / 無細胞タンパク質合成系 |
|---|
| Research Abstract |
Na/K-ATPaseは、分子量約10万の触媒鎖(α鎖)と糖タンパク質のβ鎖からなる膜タンパク質で、本酵素の機能発現には、αβプロトマーからなるオリゴマー構造((αβ)_<2n>構造)の形成が非常に重要であることが明らかにされている。本研究では、タンパク質の発現をコントロールしやすい無細胞タンパク質合成系を用いることで、Na/K-ATPase合成過程におけるαβプロトマー形成やオリゴマー構造の構築を詳細に追跡することが可能になると考え、小麦胚芽抽出液を用いたタンパク質合成系によるNa/K-ATPaseの機能的発現系の確立を目指して研究を行った。昨年度の研究過程で作成したプラスミッドベクターを用いて、His-tag/Myc-tag/Flag-tagや蛍光タンパク質をN-末端に付加したNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質の合成を行った。合成反応後の試料をSDS-PAGEで解析したところ、CBB染色で合成が容易に検出できる量のα鎖・β鎖タンパク質を合成することができた。このタンパク質のみがN-末端のタグを認識する抗体と反応することから、非常に均一なタンパク質が合成できていることが明らかになった。しかし、α鎖・β鎖面タンパク質を同時に合成すると分子量の大きなα鎖の合成量が大きく減少した。また、膜分画を添加すると、混入するRNaseによるmRNAの分解を完全に阻害することが困難であることから、タンパク質の合成量は著しく減少した。合成されたNa/K-ATPaseを用いて、特異的阻害剤ウワバインで阻害可能なATP加水分解活性やATPase活性の部分反応の検出を試みたが、機能的発現を確認することはできなかった。また、N-末端のタグを認識する抗体を用いた共沈殿実験や蛍光エネルギー移動による、αβ複合体の形成についても検討したが、α鎖・β鎖間相互作用を示唆する結果を得ることはできなかった。
|
