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SH3ドメインに高親和性・特異的ペプチドの立体構造に基づいたライブラリデザイン

Research Project

Project/Area Number 16657045
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Biophysics
Research InstitutionKyushu University

Principal Investigator

神田 大輔  九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 前仲 勝実  九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (10322752)
Project Period (FY) 2004 – 2005
Project Status Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2005: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2004: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
KeywordsSH3ドメイン / プロリンリッチ配列 / ファージディスプレイ / 環状ペプチド
Research Abstract

SH3ドメインはプロリンリッチ配列(PXXP配列)に結合するドメインである。市販のファージライブラリPh.D.-C7Cファージディスプレイペプチドライブラリキット(BioLabs社)を用いて,p67^<phox>蛋白質のSH3ドメインに結合するペプチドを選択した.p67^<phox>蛋白質のSH3ドメインをGST融合タンパク質として大腸菌を用いて発現・精製した.Glutathione coated96穴HS plateプレートを用いてGST部分でプラスチックに結合させ,方向が制御された状態の固相化をおこなった.また,溶液中での選択を行うためGST Magnet Agarose Beadsを用いてプルダウンを行った.特異的に吸着したファージを溶出し、大腸菌に感染させ、プラークを得た。このパンニング操作を3回繰り返した。結果はファージELISAを使って確認した.ファージライブラリPh.D.-C7Cペプチドライブラリキットは,7残基のランダムライブラリであり,両端のシステインがSS結合を形成して環化している.PXXPを含む配列が繰り返し得られた.得られた4つのアミノ酸配列をペプチド合成し,SS結合を作らせて環化した.質量分析とDTNBによるSH基の定量で確認した.^<15>Nラベルしたp67^<phox>蛋白質のSH3ドメインを調製した.p67^<phox>SH3はシステイン残基をセリンに変えた変異体であるが,これはリガンドが結合していない状態ではアンフォールドしているが,リガンドが結合するとフォールドする性質をもっている.4種のペプチドのうち1つがSH3ドメインをフォールドさせることができた.このペプチドはSS結合でコンホメーションが制限されているので,通常のポリプロリンヘリックス2型のコンホメーションで結合しているとは考えにくい.NMR測定をおこなって構造情報を収集した.

Report

(2 results)
  • 2005 Annual Research Report
  • 2004 Annual Research Report

URL: 

Published: 2004-04-01   Modified: 2016-04-21  

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