生物時計装置の一分子測定

• Project/Area Number: 16657056
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Cell biology
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 康雄 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70154507) ; 井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90223297)
• Project Period (FY): 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2004: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
• Keywords: 藍色細菌 / 生物時計 / 時計タンパク質 / 分子装置 / KaiC / 六量体 / リン酸化 / 相互作用

Research Abstract

藍色細菌の生物時計は時計タンパク質(KaiA、KaiB、KaiC)及び時計関連タンパク質(Pex、SasA)から構成される。それらタンパク質、タンパク質複合体による時計の分子装置の作用機構-「時計の分子装置がどのようにして、24時間周期の振動を発振するか」-の原子レベルでの解明を目指し、時計の中核構成因子であるKaiCに着目した。KaiCは相同性のあるN末端及びC末端ドメインからなっており、それぞれのドメインの役割は不明であった。それらの役割を決定するため、各ドメインを個別に大量発現、調製を行い、以下のような結果を得た。(1)N末端ドメインはKaiC六量体化に不可欠であった。(2)C末端ドメインにリン酸化活性があった。(3)C末端ドメインにKaiAは相互作用し、KaiCリン酸化を促進した。(4)リン酸化反応はサブユニット間で起きた。これら結果から、六量体型KaiCはN末端ドメインで比較的強固なリング構造を形成し、C末端ドメインがそのリング構造にぶら下がり、フレキシブルに可動できる構造を提唱した。そして、KaiCの様々な存在状態(ヌクレオチドを結合していないKaiCサブユニット、ATPを結合したKaiCサブユニット、ADPを結合したリン酸化型KaiCサブユニット、ヌクレオチドを結合していないリン酸化型KaiCサブユニット等)の連続的変換が時計発振には重要と考えた(林ら、論文投稿中)。
今後は、これら各状態の原子構造を決定し、スナップショットによるKaiC構造の動態と時計発振の関係を明らかにする。また、KaiAはKaiCと相互作用し、KaiCリン酸化状態に影響を与える。そのメカニズムを解明するため、KaiA-KaiC複合体の構造決定を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Global Analysis of Circadian Expression in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803. (2005)
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tsuchiya, Y., Nomura, S., Nango, M., Kanehisa, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 187 Pages: 2190-2199
• [Journal Article] 生物時計装置を原子レベルで解明する (2005)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 林史夫, 石浦正寛
  • Journal Title: 蛋白質・核酸・酵素 50 Pages: 111-120
• [Journal Article] Crystal structure of the C-terminal clock-oscillator domain of the cyanobacterial KaiA protein. (2004)
  • Author(s): Uzumaki, T., Fujita, M., Nakatsu, T., Hayashi, F., Shibata, H., Itoh, N., Kato, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Nature Struct.Mol.Biol. 11 Pages: 623-631
• [Journal Article] Circadian rhythms in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus : compensation of period length over a wide temperature range. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Morishita, M., Itoh, S., Okamoto, K., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 186 Pages: 4972-4977
• [Journal Article] Large-scale screening of Arabidopsis circadian clock mutants by a high-throughput real-time bioluminescence monitoring system. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Okamoto, K., Nishimoto, H., Morioka, C., Hirano, M., Kami-ike, N., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant J. 40 Pages: 1-11
• [Journal Article] Determinants of sensitivity and specificity in spotted DNA microarrays with unmodified oligonucleotides. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Yoneda, H., Harada, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 189-197
  • NAID: 10014154547
• [Journal Article] Roles of two ATPase-motif-containing domains in cyanobacterial circadian clock protein KaiC. (2004)
  • Author(s): Hayashi, F., Ito, N., Uzumaki, T., Iwase, R., Tsuchiya, Y., Yamakawa, H., Morishita, M., Onai, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 279 Pages: 52331-52337
• [Journal Article] Construction of unmodified oligonucleotide-based microarray in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Tsuchiya, Y., Okumoto, Y., Harada, M., Yamada.M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 319-329
• [Journal Article] 分子装置としての生物時計 (2004)
  • Author(s): 石浦正寛
  • Journal Title: 名大トピックス 139 Pages: 34-35
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの構造と機能 機能ドメイン、X線結晶構造解析及び構造-機能相関の解明 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 中津亨, 加藤博章, 石浦正寛
  • Journal Title: SPring-8 Information 9 Pages: 367-371
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの原子構造と時計機能 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 石浦正寛
  • Journal Title: ブレインテクノニュース 105 Pages: 25-29
• [Journal Article] RAP, an integrated program for monitoring bioluminescence and analyzing circadian rhythms in real time.
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ishiura, M
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Journal Article] Identification of novel clock-regulated genes by cDNA macroarray analysis in Chlamydomonas reinhardtii
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tabata, S., Fukuzawa, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant Mol.Biol. (印刷中)
• [Journal Article] Improvement of the bioluminescent reporter system for real-time monitoring of circadian rhythms in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803
  • Author(s): Kucho, K., Aoki, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. (印刷中)
• [Journal Article] An automated apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ezaki, N., Ofuchi, T., Ishiura, M.
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Patent(Industrial Property Rights)] 葉緑体で機能するホタルルシフェラーゼ遺伝子とそれを用いた葉緑体遺伝子発現のリアルタイムモニタリング (2005)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 松尾 拓也, 小内 清
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2005-029217
  • Filing Date: 2005-02-04
• [Patent(Industrial Property Rights)] 制御プログラム及び培養装置 (2004)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 岡本 和久
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2004-380651
  • Filing Date: 2004-12-28