| Project/Area Number |
16658037
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Applied microbiology
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村田 幸作 京都大学, 農学研究科, 教授 (90142299)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河井 重幸 京都大学, 農学研究科, 助手 (00303909)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2004: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
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| Keywords | 形質転換 / DNA輸送 / 酵母 / S.cerevisiae / エンサドイトシース / YOYO-1 / Nanogold / Pan1p / 非必須遺伝子欠損株 / 形質転換能 / DNA取り込み / arp2 / 3複合体 / エンドサイトーシス / クラスリン / アクチン |
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| Research Abstract |
本研究では、酵母の形質転換(DNA輸送)機構の更に詳細な知見を得るため、形質転換プロセスの可視化を行った。また、本DNA輸送において重要な役割を果たすと予想されるPan1pの機能解析も試みた。標識試薬YOYO-1はDNAと強く結合し、かつDNAと結合したときのみ蛍光を発する。しかも、YOYO-1は細胞膜を通過しない。本研究では、YOYO-1で標識したDNA(YOYO-1/DNA)を用いて酵母細胞の形質転換を行い、同複合体を蛍光顕微鏡で追跡した。その結果、最初にYOYO-1/DNAが酵母細胞壁周辺を染色する様子が観察された。更に詳細な情報を得るため、Nanogoldで標識したDNA(Nanogold/DNA)を用いて、電子顕微鏡により観察したところ、Nanogold/DNAが細胞壁周辺に結合していた。これは、蛍光顕微鏡による観察結果と一致した。更に、Nanogold/DNAが細胞壁内、細胞膜周辺、及び細胞内にも観察された。特に、Nanogold/DNAが細胞膜の陥入に伴い、エンドサイトーシス様の細胞膜陥入、即ち「超チャネル」により細胞内に取り込まれる様子を観察することに成功した。酵母「超チャネル」の分子機構を明らかにするため、本「超チャネル」において重要な役割を果たすと予想されるPan1pに着目した。Pan1pは、多様なドメインから構成され、各ドメインが多くのエンドサイトーシス(細胞膜陥入)因子と相互作用する。従って、Pan1pにおいて、細胞膜陥入と形質転換に必須の領域を明らかにすることにより、Pan1pを介した細胞膜陥入過程の詳細な知見が得られると期待した。本研究では、少なくともPanlp生育必須領域が細胞膜陥入と形質転換に必須の領域であることを明らかにした。
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