フーリエ変換赤外分光分析法を用いた細胞内化学反応の直接定量法の開発

• Project/Area Number: 16658041
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 宮崎 均 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 教授 (40183636)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 礒田 博子 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 助教授 (00375429) ; 土渕 毅 島津製作所, 応用技術部・東京カスタマーサポートセンター, 主任
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000); Fiscal Year 2005: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2004: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: FT-IR / 赤外分光分析 / 半導体

Research Abstract

有機化合物は赤外波長領域(2.5-25μm)において、官能基等に依存した固有の吸収スペクトルを持つ。本研究では、(1)細胞内シグナル伝達の中心をなすキナーゼとホスファターゼの活性を、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)を用いて簡便にin vitro測定する手法を確立する、(2)これを発展させ、大腸菌内で非破壊的に、すなわちin situでキナーゼの変異と活性相関を解析するシステムを開発する、ことである。(1)に関しては、キナーゼ反応に共役して起こる「ATP→ADP+リン酸」の反応を利用した.リン酸基に帰属する特有のスペクトルが1200cm^<-1>以下の波数領域に現れ、リン酸基を3つ持つATPと2つ持つADPの間で、明らかに異なるスペクトルが観察され、ATPからADPの変化を定量化することに成功した。この系を用い、微生物由来の可溶性ATPaseとその基質であるATPを反応させると、リアルタイムで「ATP→ADP+リン酸」の変化が観察され、少なくとも、様々な生化学反応に連動しておこるATPase活性のFT-IRを用いた定量の基本形が確立された。現時点での感度は200μM程度であり、感度を上げるために検出器を改良中である。また、より少量での測定を可能にするためセルも改良中である。さらに、上記は赤外線の透過を測定しているが、感度および測定の簡便さを追求するため、同時に半導体を用いた多重反射によるスペクトル観察も行っている.現在のところ透過に比べ感度が落ちるが、セルや半導体の材質を変えるなど検討中である。