| Budget Amount *help |
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2005: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2004: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
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| Research Abstract |
Seトランスポーターの運搬・取り込み機構の解析
Jurkat細胞に可変量の放射標識SePを加え,4℃で1時間反応した.反応終了後,細胞への結合量を測定し,スキャッチャードプロットを行った.その結果,SePに対する受容体の数は2,200±1,500per cell (n=4,mean±SEM),解離定数Kdは0.67±0.33nMと求められた.
また,放射標識SePとJurkat細胞を反応後,架橋試薬を加えた試料についてSDS-PAGEとオートラジオグラフィで解析を行い,SeP受容体の存在を調べた.その結果,架橋試薬disuccinimidyl suberateと反応した場合,試薬無しで見られた66KDaのバンド(SePに由来)は消失し179KDaのバンドが新たに出現した.500倍量の非標識SePを共存するとこのバンドは消失することから,この反応が特異的であることが確認された.両者の差,すなわち110KDaのSeP受容体の存在が示された.
SePがJurkat細胞にSeを供給していることを確かめるため,細胞と放射標識SePを37℃で3日間培養後,細胞内のSe含有蛋白質の新規合成が行われているかSDS-PAGEとオートラジオグラフィで解析を行った.55,23,20及び15kDaのバンドが認められ,これらのバンドが抗SeP抗体で免疫沈降されないことから,新規Se含有蛋白質の合成が確認された.
以上の結果から,SeP受容体の存在とSePがこの受容体を介して細胞内にSeを供給していることが証明された.
SeP受容体の同定の試み
SeP不溶化カラムにJurkat細胞膜画分を添加後,結合物の回収・分析を試みた.しかし,構造解析などの分析に十分な量の試料を確保することが出来なかった.今後,より多量の膜画分を用いるなど工夫を加えて,最終的にSeP受容体の同定を目指す予定である.
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