| Project/Area Number |
16659053
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
General physiology
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
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| Project Period (FY) |
2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | プレスチン / 外有毛細胞 / ゲート電流 / 細胞収縮 / 構造機能連関 / 細胞長変化 / 単粒子構造解析 / バキュロウイルス |
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| Research Abstract |
内耳の外有毛細胞は、膜電位変化に伴い伸縮しその細胞長を変える。10kHz超という驚異的に直速の膜電位変化にまで細胞長伸縮が追従するため、その機構は長く関心の的であった。2000年に、膜電位を細胞長に変換する分子として、陰イオントランスポーターSLC26ファミリーに属する分子"プレスチン"が同定された。「プレスチンによる膜電位-細胞長変換の分子機構とその生理的意義を明かにする」というゴールへ向けて、本研究では、プレスチン分子の単粒子構造解析を行うことを具体的目標として、その蛋白の精製を行った。プレスチンのN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトの作成、baculo virusベクターへの組み換えを行い、昆虫細胞Sf9に感染させることにより高タイターのbaculo virusを得た。また、プレスチンを認識する特異抗体の作成にも成功し、この抗体、およびFLAG抗体を用いて、Sf9細胞における発現を解析したところ、非常に強く細胞膜上に発現していることが確認された。感染Sf9細胞のストックをlarge scaleで作り、膜画分蛋白を、FLAG affinityカラム、および、ゲルろ過カラムで精製した。ゲル電気泳動し、銀染色およびWestern blottingにより精製を確認したところ、十分な収量の精製産物が得られていたが、かなりのaggregationが起きていた。今後、この点を克服するために、detergentの種類、pH緩衝剤の種類、溶液のイオン強度、glycerolやsucroseの添加濃度等の精製条件について系統的に検討すると共に、lipidの添加による蛋白の安定化も試みる。十分なクオリティーの精製蛋白が得られ次第、単一粒子構造解析に進む計画である。
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