| Project/Area Number |
16659371
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Thoracic surgery
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高野 弘志 阪大, 医学(系)研究科(研究院), 助手 (70346196)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮本 裕治 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80229898)
澤 芳樹 大阪大学, 医学部附属病院, 助教授 (00243220)
福嶌 教偉 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (30263247)
市川 肇 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (60303939)
松宮 護郎 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (20314312)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | 虚血性脊髄障害 / 遺伝子導入 / HVJ-E |
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| Research Abstract |
1 実験動物による脊髄虚血モデルの作成
Japanese white rabbit(2.5Kg-3.0Kg)を用いて脊髄虚血モデルを作成した。大腿動脈より4Fr Fogarty catherterを挿入し、腎動脈下でinflationし脊髄虚血にした。15分虚血後reperfusionし、一週間後犠牲死するまで神経学的評価を毎日行い、犠牲死させたあと組織学的評価を行なった。また各蛋白の発現をみるために別にreperfusion後、8hr,24hr,48hr後に犠牲死させた。
A)神経学的評価
下肢運動評価は肉眼的所見としてJohnson scoreを用いて(0から5点、正常が5点)行った。虚血後2日目の平均scoreは4.4±1.2(n=5)でほぼ正常下肢運動能を保ったが、7日目には2.2±1.3(n=5)であり、遅発性下肢運動麻痺を示した。
B)組織学的評価
H-E染色にて虚血2日目の生存motor neuron数はsham control群(19.0±1.0),脊髄虚血群(18.0±2.3)と変化はないものの術後7日目には、sham群に比べ60%のmotor neuronが選択的に減少(7.8±3.1:p<0.0001)。15分虚血後motor neuronは2日間生存するが、それ以降選択的に細胞死した。またTUNEL染色にても2日目までにTUNEL陽性細胞を認め、細胞死にapoptosisの関与が示唆された。また免疫染色により虚血後8時間目にstress induce proteinであるHeat shock proteinが発現されていた。また免疫染色によりangiogenic factorであるVEGFの発現は虚血後8時間に認められた。またWestern blotting法にて同様に両蛋白の発現が認められた。
2 non-viral vector HVJ-Eを用いた遺伝子脊髄導入実験
luciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれHVJ-Eに封入し実験動物への脊髄へ導入する。導入後luciferase活性を検討し導入効率を定量化し、またVenus遺伝子を導入し組織学的に脊髄の導入される局在を検討した。まずバルーンを腎動脈直下で閉塞させたあと、もう一つのバルーンを大動脈分岐部に位置させて、このバルーン先端よりluciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれ封入したHVJ-Eを注入し、腰動脈より脊髄へ経動脈的にtransfectionを行った。しかし摘出脊髄からはluciferase活性は認められず、また病理学的にもVenusの発現は認めなかった。経動脈的に脊髄へのHVJ-Eを用いた遺伝子導入は困難であり、今後脊髄への直接穿刺による遺伝子導入を行う予定である。
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