| Project/Area Number |
16659446
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Obstetrics and gynecology
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
井上 正樹 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (10127186)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
京 哲 金沢大学, 医学系研究科, 講師 (50272969)
村上 弘一 金沢大学, 医学部付属病院, 助教授 (20242555)
金谷 太郎 金沢大学, 医学部附属病院, 助手 (30303308)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
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| Keywords | 内分泌撹乱化学物質 / ダイオキシン / テロメレース / hTERT / 転写因子 / エストロゲン / 内分泌撹乱物質 |
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| Research Abstract |
我々はテロメレースの触媒サブユニットであるhTERT promoterをクローニングし、hTERT転写発現機構を詳細に解析してきた。ダイオキシンによる遺伝子発煙誘導には遺伝子プロモーターに存在するTNGCGTGというコア配列からなるXRE(xenobiotic responsive element)と呼ばれるエンハンサー配列が必要であるが、hTERT promoter上には類似の配列が存在する。そこで我々は内分泌攪乱物質であるダイオキシジンがテロメレース発現に及ぼす影響について検討した。
1 HeLa細胞にダイオキシン(2,3,7,8-tetrachlorodibenzzo-p-dioxin)を種々の濃度で作用させ、48時間および72時間後にテロメレース活性をTRAP assayにて計測したところコントロール群に比べ約1.5-2.5倍の明らかなテロメレース活性の上昇を認めた。HTERT mRNAの発現をRT-PCRで検討したところ、24〜48時間後にmRNAレベルの有意な上昇を認めた。
2 3.2kbの全長のHTERT-promoter luciferase reporterを作製し、HeLa細胞にtransfect後、ダイオキシンを作用させ、48時間後にluciferase assayを行った。ダイオキシン作用によりhTERT promoterの転写活性が2-3倍に上昇した。hTERT promoterのdeletion mutantを作製し同様にluciferase assayを行ったところ、ダイオキシンに反応するpromoter領域を転写開始部上流の約800bpまでの領域に認めた。この領域はXRE類似配列を含んでいた。
3 XRE類似配列に対するダイオキシンレセプターの結合をゲルシフトアッセイで検討中したところ、binding complexが検出された。このバンドはダイオキシンレセプター抗体の添加によりsupershiftすることから、特異的な結合であると確認された。
4 結合部位に変異を導入したhTERT promoterを用いて、2と同様にluciferase assayを行ったところ、ダイオキシンによる転写活性化能はcancelされた。
以上のことから、ダイオキシンがその特異的レセプターを通じてhTERT promoter上のXRE類似配列に作用することでhTERT転写活性を調節し、テロメレース活性化をもたらす分子機構を明らかにした。
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