| Project/Area Number |
16659500
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Morphological basic dentistry
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| Research Institution | Nihon University (2005)
Kyushu University (2004) |
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Principal Investigator |
花澤 重正 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60060258)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 善夫 九州大学, 歯学研究院, 助教授 (80253459)
舛広 善和 日本大学, 大学院・総合科学研究科, 講師 (00336083)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
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| Keywords | TLR / MALD-TOF / 相互作用因子 / シグナル伝達 / 制御因子 / 細菌成分 / プロテオーム解析 / サイトカイン / マクロファージ / 相互作用蛋白質 / 細胞内情報伝達 |
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| Research Abstract |
私達はMALD-TOF法によるTLRシグナル分子相互作用蛋白質の検索法を確立するために、ごく最近示されたSOCSがTLRシグナル分子であるIRAK-4やIRAK-1と相互作用するという知見をもとにHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質を用い、MAD-TOF法をによるその検索法を確立することを試み。以下の結果を得た。
1.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとしたものと、His-Tagコントロールを、各々HeLa細胞細胞質抽出液と混和した後、精製したHis-Tag及びHis-Tag融合hSOCS-3結合タンパク質群をSDS-PAGE、二次元電気泳動により分離した。
2.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質に特異的に結合すると見られるタンパク質スポットをMALDI-TOFMSによる質量分析によって同定した。その結果、13種類のタンパク質を同定できた。
3.同定した蛋白質の中で微小管形成中心プラス端集積因子EB1と細胞骨格構成分子であるactinβ(以下、ACTB)が細胞内で相互作用する可能性が高いことがわかった。
4.HEK293T細胞にFLAG-hSOCS-3を強制発現させ、FLAG抗体レジンで免疫沈降を行い、EB1抗体とACTB抗体でそれぞれ検出を行った。その結果、hSOCS-3と内因性発現レベルのEB1、ACTBは相互作用することが確認できた。
以上、私達はHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとし細胞質抽出物より、その結合蛋白質を精製し、その相互作用蛋白質を同定するためのMAD-TOF法を用いた検索法を確立することができた。この方法は歯周疾患病原細菌成分のTLRシグナル伝達系の分子の制御因子を探索する上で有効であると思える。
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