MMP-9/RNAiによる癌の浸潤転移抑制と細胞分化療法の開発

Research Project

Project/Area Number	16659560
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Surgical dentistry
Research Institution	Health Sciences University of Hokkaido
Principal Investigator	柴田考典北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60147220)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	奥村一彦北海道医療大学, 歯学部, 講師 (60194510)
Project Period (FY)	2004 – 2005
Project Status	Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help	¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000) Fiscal Year 2005: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 2004: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Keywords	MMP-9高産生癌細胞 / MMP-9高発現クローン / 癌細胞遊走能 / 基底膜浸潤能 / 細胞直接性 / 細胞間接着分子 / RNAi / 細胞分化療法 / 細胞接着性
Research Abstract	研究目的:口腔扁平上皮癌細胞のMMP-9mRNAをsiRNAでノックダウンした際の細胞のシグナル分子や接着分子の挙動を明らかにして、MMP-9を標的としたRNAiによる癌治療効果について検討した。研究方法:細胞として浸潤能が亢進している培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞株SAS-H1、IS-FOM、BSC-OFを用いた。 1.MMP-9高産生細胞の作製:ヒトMMP-9遺伝子はGeBank accession No.NM-004994からRNA sequenceを得て、そのcoding region 377-403をもとにPCRにより全長を得て、lacZ-レポーター遺伝子プロモーター領域をつないだアデノウィルスプラスミドベクターを用いて遺伝子導入を行った。G418の選択培地でMMP-9高発現クローンを得た後、MMP-9産生をゼラチンザイモグラフィで確認した。 2.MMP-9高発現クローンの浸潤性への影響:Transwell chamber上に2×10^4個の細胞を播種して、培養後16時間経過し8μmのporeを有するpolycarbonate filterを通過した細胞数を測定し細胞遊走能を評価した。また、培養後72時間経過し再構成基底膜matrigel^<TM>をコートした同数のpolycarbonate filter(30μg/filter)を通過した細胞数を計測し、基底膜浸潤能として評価した。さらに基底膜基質としてmatrigel^<TM>、fibronectin、laminin、collagen typeIIIおよびcollagen typeIVをそれぞれコートした35-mm培養皿(BIOCOAT Cellware : BD lab)に1×10^5個の細胞を播種して、培養後6時間経過時の培養皿底面に付着した細胞を回収し、ヘモサイトメーターで計測し、細胞接着性の評価を行った。結果:1.MMP-9高発現クローンを作製し、MMP-9産生がゼラチンザイモグラフィで確認された。2.クローン株の細胞遊走能、基底膜浸潤能、および細胞接着性について現在計測中である。