頭頚部癌細胞由来RNAヘリカーゼのクローニングと機能解析

• Project/Area Number: 16659565
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Surgical dentistry
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 古澤 清文 (2005) 松本歯科大学, 大学院歯学独立研究科, 教授 (90165481); 橋本 雅幸 (2004) 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (10367518)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上松 隆司 松本歯科大学, 大学院歯学独立研究科, 助教授 (40203476) ; 堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (40329470) ; 古澤 清文 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 教授 (90165481)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2005: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2004: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: 頭頸部癌 / ヘリカーゼ / 酵素 / RNAヘリカーゼ / クローニング / cDNAライブラリー

Research Abstract

【目的】本年度の研究では、分離された頭頸部癌培養細胞から抽出した蛋白に対するポリクローナル抗体を作成し、遺伝子クローニングを行った。
【方法】以下の方法で行った.
1.頭頸部癌培養細胞から抽出したα-N-acetylgalactosaminidase活性を示す蛋白を抗原とし、ウサギを宿主としてポリクローナル抗体を作製した。
2.頭頸部癌のHela細胞より抽出したmRNAを抽出し、1^<st> strand cDNAを調製後、UNIZAP XR VECTORに挿入してcDNAベクターライブラリーを作製した。ファージベクターのホストとしてXL-1 Blueを用いた。
3.XL-1 Blueを用いてファージタイターは2.4×10^<12>Pfu/mlで、このファージライブラリーを用いてクローニングを行った。
4.IPTGを添加したNZY平板培地に、ファージを吸着させたXL-1 Blueをまき、42℃の温度シフト後に形成されたプラークをブロッティング膜に転写させた。作製したポリクローナル抗体を用いてECL法によってクローンを検出した。
【結果】Hela細胞より抽出した、約2500塩基のリーディングフレームを持つ新規mRNAをクローニングした。本蛋白は、DEVD Boxを有し、N末端側に塩基性アミノ酸配列と核移行シグナルが、またC末端側には回文構造がみられた。NCBIのBlastnによる解析では、RNAヘリカーゼ様構造を持つとともに、α-ガラクトシダーゼやグルクロニダーゼとの相同性もみられ、糖鎖構造を脱糖鎖する機能を有すると考えられた。