インスリン開口放出準備過程における調節機構の2光子励起解析

• Project/Area Number: 16689007
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General physiology
• Research Institution: The University of Tokyo (2006); National Institute for Physiological Sciences (2004-2005)
• Principal Investigator: 高橋 倫子 東京大学, 大学院医学系研究科, 特任講師 (60332178)
• Project Period (FY): 2004 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥18,070,000 (Direct Cost: ¥13,900,000、Indirect Cost: ¥4,170,000); Fiscal Year 2006: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2005: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2004: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 閉口放出 / 膵ランゲルハンス島 / インスリン / 蛍光 / 画像法 / 2光子励起 / ホルモン / 分泌 / 2光子励起画像法 / 内分泌 / 開口放出 / 糖尿病 / 蛍光標識 / 膜融合

Research Abstract

膵島でのインスリン分泌は、糖尿病の成因に深く関わり、その分泌不全は疾患を引起す原因の一つと考えられている。分泌の最終過程にあたる開ロ放出、およびその準備段階にあたる分泌穎粒の動員機構にも、異常の存在が示唆される。
研究代表者は膵島標本内部でおこるインスリン開ロ放出過程を、2光子励起画像法を用いて定量解析するする手法を近年確立した。この励起法の、同時多重染色性を応用して、開ロ放出の起こる時期に関連蛋白質(SNARE蛋白)がどのように構造変化するかを検討した。SNAP25がほかのSNARE蛋白と複合化する際に接近することが示唆されている二箇所に、二種類のGFP変異たんぱく質をふくむ分子内FRETプローブを作製した。当プローブのcDNAをマウ久膵島に遺伝子導入し、発現させた。水溶性蛍光色素液内でグルコースによりインスリン分泌を刺激し、開ロ放出の出現部位におけるFRET効率の変化を、同時三重染色により経時的に測定した。その結果、開ロ放出現象の約2割において、膜融合開始時点に平均3秒先行して、分子内FRET比の一過性上昇が検出された。本プローブを大腸菌に合成させて生化学的に検討したところ、syntaxin 1の存在下に高いFRET比を示すことも確認した。
平行して、インスリン穎粒動態を検討するために光活性型GFPで修飾したVAMP2のcDNAプローブも作成した。このプローブ発現細胞の一領域を720nmの超短パルスレーザーで光活性化することに成功した。現条件では顆粒状蛍光領域の可動性が少なく、その拡散や開ロ放出との関連性については検討中の段階にある。

Research Products

• [Journal Article] Exocytic Process Analyzed with Two-photon Excitation Imaging in Endocrine Pancreas (2007)
  • Author(s): Takahashi N., Kasai H.
  • Journal Title: Endocrine J (In press)
  • NAID: 130004770028
• [Journal Article] Hepatocyte nuclear factor-4 α is essential for glucose-stimulated insulin secretion by pancreatic beta-cells. (2006)
  • Author(s): Miura A, Yamagata K, Takahashi N., Shimomura I et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem 281 Pages: 5246-5257
• [Journal Article] Two-photon excitation imaging of exocytosis and endocytosis and determination of their spatial organization. (2006)
  • Author(s): Kasai H., Takahashi N.et al.
  • Journal Title: Advanced Drug Delivery Reviews 58 Pages: 850-877
• [Journal Article] Vacuolar sequential exocytosis of large dense-core vesicles in adrenal medulla (2006)
  • Author(s): Kishimoto T., Takahashi N., Kasai H.et al.
  • Journal Title: EMBO J 25 Pages: 673-682
• [Journal Article] Rab27a mediates the tight docking of insulin granules onto the plasma membrane during glucose stimulation. (2005)
  • Author(s): Kasai K et al.
  • Journal Title: J.Clin.Invest. 115(2) Pages: 388-396
• [Journal Article] Sequential exocytosis of insulin granules is associated with redistribution of SNAP25. (2004)
  • Author(s): Takahashi N et al.
  • Journal Title: J.Cell Biol. 165(2) Pages: 255-262
• [Book] Pancreatic beta cell in health and disease (2007)
  • Author(s): Takahashi N, Kasai H
  • Publisher: Springer Verlag社(In press)