多様な形態・細胞表層構造をもつ細菌の土壌カラム中における挙動の解析

• Project/Area Number: 16710045
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Environmental technology/Environmental materials
• Research Institution: Yokohama National University
• Principal Investigator: 鈴木 市郎 横浜国立大学, 大学院・工学研究院, 助手 (90303081)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2005: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2004: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: バイオオーギュメンテーション / 土壌細菌 / 土壌 / 吸着 / 石英砂 / 吸着率 / 性繊毛 / 定量的PCR / Langmuir式 / スキムミルク / PCR-DGGE

Research Abstract

土壌の汚染を汚染物質分解菌を添加して浄化するバイオオーギュメンテーションにおいて、添加する細菌の土壌への吸着を評価する手法を確立することを目的とし、様々な細菌の土壌への吸着を解析した。また、土壌より特徴的な土壌吸着能を持つ菌を分離することを目的とし、土壌中の細菌を定量的に検出する手法の構築を行った。
1.土壌への細菌の吸着能の指標化。細菌を吸着させる担体として石英砂を用いた。初年度に引き続き、カラム実験より操作が簡便なバッチ法で、細菌の吸着の指標化を試みた。NaCl等の溶液に大腸菌を懸濁して石英砂に添加し一定時間振とう後、非吸着の細胞数をコロニー計数法で測定した。大腸菌の吸着はLangmuir式に従うと予測されたため、最大吸着量や平衡定数の測定を試みたが、誤差が大きく再現性の高い結果が得られなかった。一方、吸着率を求めたところ、実験に用いた細胞濃度の範囲内(10^3-10^4CFU/ml)では、添加した細胞濃度にかかわらず吸着率は似た値を示した。溶液のイオン強度を上げると吸着率は上昇した。30,60mM NaCl溶液では、大腸菌DH5α株はそれぞれ29%、33%の吸着率を示したが、性繊毛を有する大腸菌JM109株はそれぞれ39%、52%と高い値を示した。他の性繊毛を有する株でも同様の傾向が見られ、細菌の吸着能の指標として吸着率を用いることが簡便であり、性繊毛が細胞の石英砂への吸着能を上昇させることが示唆された。
2.土壌中の細菌の定量的検出法の構築。初年度のDNA抽出法、PCR-DGGEによる解析法の確立に引き続き、抽出したDNA中の16S rRNA遺伝子量を定量的PCRで測定することを目的とし、標準試料として、プラスミドに様々な細菌の16S rRNA遺伝子をクローニングしたものを構築した。これらの指標・手法により、土壌から特徴的な吸着能を持つ菌の分離を行うことが可能である。