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コンビナトリアル生合成を指向したインドールジテルペンの酵素的合成

Research Project

Project/Area Number 16710150
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Living organism molecular science
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

常盤野 哲生  北海道大学, 大学院・理学研究科, 助手 (50312343)

Project Period (FY) 2004 – 2005
Project Status Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywordsindol diterpene / combinatorial biosynthesis / paxilline / emindole / 3-geranylgeranylindole / epoxidation / cyclization / biosynthetic gene cluster of paxilline
Research Abstract

多様な構造を有するインドールジテルペン化合物の酵素による骨格構築に向け、マイコトキシンであるpaxillineの骨格構築に関わる候補遺伝子を発現し、酵素反応を検討した。paxillineおよびemindole-DAの生合成における鎖状前駆体が3-geranylgeranylindole(GGI)であることは、平成16年度に証明済みである。
前年度の結果を踏まえ、鎖状前駆体GGIのエポキシ化および環化を触媒する酵素を特定するべく、酵素活性の検出を試みた。まず、酸化酵素の候補遺伝子(paxM)を発現ベクターpET-28aに組み込み、大腸菌(BL21)内で発現した。菌体を破砕しタンパクの可溶性画分を粗酵素液とした。酸化酵素の反応に通常用いられる補因子(FAD/NADPH,FMN/NADH)を添加して粗酵素液によるGGIのエポキシ化反応を検討した。補因子や緩衝液の組み合わせなど種々の条件で反応を行ったが、これまでのところ活性の検出には成功していない。次に環化酵素の候補遺伝子(paxC)を同様に大腸菌内で発現し、GGIのm-chloroperbenzoic acid処理により別途合成した17,18-epoxy-GGIの取り込み実験を行ったが、環化生成物を検出することは出来なかった。上記の発現系とは別に、インドールジテルペン生産菌の破砕菌体およびミクロソーム画分を用いて、GGI/epoxy-GGIの変換を試みた。反応条件の検討(プロテアーゼ阻害剤、各種補因子や金属イオンの有無など)を種々行ったものの、酵素活性の検出には至らなかった。更にpaxMと類似のエポキシ化機能を有するとされる他の酸化酵素を用いて、反応条件の設定を探ることにした。ポリエーテル系抗生物質の生合成における酸化酵素遺伝子を発現し、GGIと同様の3.置換オレフィンの酸化反応を検討したところ、反応における補因子(FAD/NADPH)を系中で触媒的に再生するためのFAD還元酵素が必要である可能性があり、既知の還元酵素SsuEを外部から添加する反応系を構築した。

Report

(2 results)
  • 2005 Annual Research Report
  • 2004 Annual Research Report
  • Research Products

    (3 results)

All 2006 2005 2004

All Journal Article (3 results)

  • [Journal Article] Biosynthetic Study of FR-900848 : Unusual Observation on Polyketide Biosynthesis that Did Not Accept Acetate as Origin of Acetyl-CoA2006

    • Author(s)
      Hiroaki, Watanabe
    • Journal Title

      Tetrahedron Letters Vol.47

      Pages: 1399-1402

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Proposed mechanism for diterpene synthases in the formation of phomactatriene and taxadiene2005

    • Author(s)
      Tetsuo, Tokiwano
    • Journal Title

      Organic & Biomolecular Chemistry Vol.3

      Pages: 2713-2722

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Biosynthesis of Indole Diterpenes, Emindole, and Paxilline : Involvement of a Common Intermediate2004

    • Author(s)
      Shuhe, Fueki
    • Journal Title

      Organic Letters Vol.6,No.16

      Pages: 2697-2700

    • Related Report
      2004 Annual Research Report

URL: 

Published: 2004-04-01   Modified: 2016-04-21  

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