Research Project
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
本研究の目標は、ヒト細胞にUV照射した直後、HSP27と共にプロテアーゼが媒介する新規のストレス応答反応を明らかにすることである。これまでのデータから、新規のストレス応答に関わると思われるプロテアーゼ活性が、HSP27自身にあるか、またはHSP27と結合した分子にあると考えられた。そこで、本研究では、まずHSP27自身のプロテアーゼ活性について検証をおこなった後、HSP27と相互作用する分子の検索からプロテアーゼを探索・同定を試みた。HSP27をGST(グルタチオンSトランスフェラーゼ)との融合タンパク質として、大腸菌の系で精製し、精製標品にプロテアーゼ活性が見いだされるか検証した。GSTアフィニティークロマトグラフィーで精製したHSP27には、弱いながらも一部のペプチドを分解する活性が見いだされたが、その後のゲル濾過や陰イオン交換カラムによる精製段階でその活性はHSP27から分離することがわかり、HSP27自身にプロテアーゼ活性は見いだせなかった。次に、GSTタグを利用してHSP27を結合したカラムに、ヒト細胞の抽出液を通し、カラム(つまりHSP27)と結合した分子をGST-HSP27とともにカラムから溶出して、HSP27と相互作用する分子の検索をおこなった。GST-HSP27とともに溶出された画分について、プロテアーゼ活性の有無を調べたところ弱いながらも活性が確認され、HSP27に結合するプロテアーゼの存在が示唆された。また、SDS-PAGEでHSP27に結合したタンパク質と思われるバンドについて、ゲルから切り出した後MS/MSシークエンシングで同定をおこなった。同定された分子中にプロテアーゼはなかったものの、いくつか興味深い分子が存在した。そのうちの一つは、HSP27と協調して熱ショック時にタンパク質合成停止にかかわる重要な働きをすることが考えられた。
