蛋白質活性再生における添加剤効果の解明と汎用的蛋白質調製系の構築

• Project/Area Number: 16760628
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biofunction/Bioprocess
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 梅津 光央 東北大学, 多元物質科学研究所, 助手 (70333846)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2005: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2004: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: 不溶性顆粒 / 大腸菌発現 / 巻き戻し / アルギニン

Research Abstract

現在、簡便で安定的な蛋白質大量調製系の構築が求められているが、最も汎用性の高い大腸菌発現系では発現した蛋白質が不活性な不溶性顆粒として沈殿してしまうことが多々ある。これまで申請者は、バイオ医薬の中心的な役割を果たしている抗体蛋白質について、実際の不溶性顆粒から高効率で巻き戻すシステム(添加剤導入段階透析法)を開発してきた。この手法は、不溶性顆粒を高濃度の変性剤で可溶化後、変性剤を段階的に除去し、最適な段階で凝集抑制剤や酸化還元剤を添加することを基本としており、様々な抗体や受容体の蛋白質で80%以上の活性再生効率を達成している。この添加剤導入段階透析法は、透析速度の制御や酸化還元剤・凝集抑制剤の添加法を改良することによって、多種多様な蛋白質の巻き戻り特性に対応できる利点がある。昨年度では、最も基本的なスーパーフォールド構造(9種類)骨格を持つ蛋白質に対して、添加剤導入段階透析法を適応させた。
そこで今年度は、単量体ではなく、多量体を形成する蛋白質への添加剤導入段階透析法を行い、多量体を形成して機能している蛋白質の巻き戻しにおいて、ドメイン間の不適切な相互作用を抑制する添加剤導入を試みた。その結果、ドメイン間の相互作用は、基本的に蛋白質表面の疎水的領域の増加と共に影響が顕著に現れることがわかった。そして、適切な二次構造を形成するまえに、ドメイン間の相互作用が大きすぎると蛋白質は凝集する方向へ進むことがわかった。その結果、CDシグナルが二次構造を示し、トリプトファン蛍光がブルーシフトする段階でアルギニンを添加することが効果的であることがわかった。

Research Products

• [Journal Article] Supercritical water treatment of biomass for energy and material recovery (2005)
  • Author(s): Matsumura et al.
  • Journal Title: Combustion Science and Technology 178 Pages: 509-536
• [Journal Article] Bioassisted room-temperature immobilization and mineralization of Zinc Oxide-High order structuration of ZnO nanoparticles to a flower-type morphology - (2005)
  • Author(s): Umetsu et al.
  • Journal Title: Advanced Materials 17 Pages: 2571-2575
• [Journal Article] Disassembly of Lignin by hydrolysis in phenol-water mixtures - Phenol as a suppressor for repolymerization - (2005)
  • Author(s): Man et al.
  • Journal Title: Journal of the Japan Institute of Energy 84 Pages: 486-490
• [Journal Article] Selective Detection of the Solid-state NMR Signals from the Bacteriochlorophyll a Dimers in a Reconstituted Light-harvesting 1 Complex (2005)
  • Author(s): Umetsu et al.
  • Journal Title: Chemistry Letters 34 Pages: 940-941
  • NAID: 10016468676
• [Journal Article] Nondenaturing solubilization of β2 microglobulin from inclusion bodies by L-arginine (2005)
  • Author(s): Umetsu et al.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications 328 Pages: 189-197
• [Journal Article] Hydrothermal synthesis of fine zinc oxide particles under supercritical conditions (2004)
  • Author(s): Ohara et al.
  • Journal Title: Solid State Ionics 172 Pages: 261-264
• [Journal Article] DNA高次構造体の形成制御とナノ粒子アセンブリ (2004)
  • Author(s): 畠山 他
  • Journal Title: 高分子論文集 61 Pages: 617-622
• [Journal Article] Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification (2004)
  • Author(s): Tsumoto et al.
  • Journal Title: BIOTECHNOLOGY PROGRESS 20 Pages: 1301-1308
• [Journal Article] Structural evidence for guanidine-protein side chain interactions crystal structure of CutA from Pyrococcus horikoshii in 3 M guanidine hydrochloride (2004)
  • Author(s): Tanaka et al.
  • Journal Title: Biochemical Biophysical Research Communications 323 Pages: 185-191
• [Journal Article] How oligomerization contributes to the thermostability of an archaeon protein. Protein L-Isoaspartyl-O-methyltransferase from Sufolobus tokodai (2004)
  • Author(s): Tanaka et al.
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry 279 Pages: 32957-32967
• [Journal Article] Flow method for rapidly producing BaTiO_3 nano-particles in supercritical water
  • Author(s): Mehrnoosh et al.
  • Journal Title: International Journal of Nanoscience and Nano technology (Accepted)
• [Journal Article] In Situ Surface Modification of AlOOH Nanoparticles in Supercritical Water
  • Author(s): Mousavand et al.
  • Journal Title: International Journal of Nanoscience and Nano technology (Accepted)