| Project/Area Number |
16760638
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Biofunction/Bioprocess
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神谷 典穂 九州大学, 大学院工学研究院, 助教授 (50302766)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2005: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 2004: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 酵素 / 蛋白質 / プロテインチップ / バイオテクノロジー / タンパク質部位特異的固定化 / 翻訳後修飾酵素 / ペプチドタグ / トランスグルタミナーゼ / 両親媒性タンパク質 |
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| Research Abstract |
本研究では、酵素トランスグルタミナーゼ(TGase)のタンパク質翻訳後修飾機能を利用する対象タンパク質の分子配向制御を志向した新規なタンパク質固定化法について検討を行った。具体的には、1)遺伝子工学的手法によるTGase認識配列の対象タンパク質への導入と導入サイトの最適化、2)TGase認識サイトが高密度に配置され,かつ非特異的タンパク質吸着を示さない基盤表面の作製、3)基盤上での目的タンパク質架橋化法の確立とタンパク質固定化状態の可視化、の3点について検討し、酵素反応を利用した部位特異的・共有結合的タンパク質固定化法を確立することを目標とした。本年度は、前年度に得られた成果を踏まえ、以下の2点について検討を行った。
i)TGase認識ペプチド配列の対象タンパク質への導入サイトの最適化
構造既知の数種のタンパク質をモデルとして、TGase認識ペプチドタグの導入位置ならびにペプチドリンカー長がTGaseによる酵素的固定化に与える影響を、固定化されたタンパク質の機能を指標として評価した。その結果、ペプチドタグの長さ、ならびにペプチドタグの導入位置により固定化収率が異なることが明らかとなった。さらに、TGaseの反応機構に基づき、タンパク質のN末端アミノ基を選択的に修飾する新手法を開発した。
ii)各種一級アミンを提示した基盤表面の調製とタンパク質の固定化
ガラス基盤を対象とし、各種シランカップリング剤を用いて種々の一級アミンを基盤表面に提示した。TGaseによる固定化条件下における対象酵素の表面電荷とタンパク質の物理吸着の関係について詳細な検討を行い、非特異吸着の抑制が可能な表面処理条件を見出すことができた。
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