蛋白質の異性化が細胞内情報伝達に及ぼす影響の解析

• Project/Area Number: 16790061
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 古地 壯光 北里大学, 薬学部, 講師 (00302167)
• Project Period (FY): 2004 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2005: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2004: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
• Keywords: アスパラギン酸 / アスパラギン / PIMT / 異性化 / ラセミ化

Research Abstract

蛋白質において、アスパラギンやアスパラギン酸残基は、異性化やラセミ化を非常に起こしやすく、その劣化に伴いL-イソアスパラギン酸(IsoAsp)およびD-アスパラギン酸(D-Asp)が生じることが知られている。本研究では、蛋白質中のアスパラギンやアスパラギン酸残基の異性化ないしラセミ化が細胞内の蛋白質機能に及ぼす影響に関して、その修復酵素であるprotein L-isoaspartate/D-aspartate O-methyltransferase(PIMT)の発現抑制細胞を作製し、それを用いることにより解析を行った。その結果、PIMT発現抑制株においてEGF刺激によるMEKおよびその下流であるERKのリン酸化の亢進および持続が認められた。そこで次に、MEKの上流であるRafのリン酸化について解析を行ったところ、同様にPIMT発現抑制株においてリン酸化の亢進が認められた。現在は、EGFシグナル伝達系に異常亢進が生じるメカニズムの解明に向け、更なる解析を行っている。
また、細胞内のPIMT活性を測定する系の開発も試みた。酵素反応条件およびHPLCの溶出条件を種々検討した結果、蛍光ラベルしたisoAsp含有ペプチドおよびそのメチル化体を分離検出する簡便なアッセイ系の確立に成功した。さらに、細胞抽出液を用いた実験においても、簡単な前処理を行うことにより、PIMT活性が測定できることを確認した。本系は全工程を含めて1時間以内で終了し、簡便かつ有用なアッセイ系であると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Cytoplasmic localization and efflux of endogenous d-aspartate in pheochromocytoma 12 cells. (2006)
  • Author(s): Koyama, Hayato
  • Journal Title: Arch Biochem Biophys. 446(2) Pages: 131-139
• [Journal Article] Free D-aspartate in mammals. (2005)
  • Author(s): Furuchi, Takemitsu
  • Journal Title: Biol Pharm Bull. 28(9) Pages: 1566-1570
  • NAID: 110003666469
• [Journal Article] A novel L-glutamate transporter inhibitor reveals endogenous D-aspartate homeostasis in rat pheochromocytoma MPT1 cells. (2005)
  • Author(s): Koyama, Hayato
  • Journal Title: Life Sci. 76(25) Pages: 2933-2944
• [Journal Article] Overexpression of Bop3 confers resistance to methylmercury in Saccharomyces cerevisiae through interaction with other proteins such as Fkh1,Rts1, and Msn2. (2005)
  • Author(s): Hwang, Gi-Wook
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. 330(2) Pages: 378-385
• [Journal Article] D-Glutamic acid-induced muscle contraction in the silkworm, Bombyx mori. (2005)
  • Author(s): Sekimizu, Kazuhisa
  • Journal Title: J Biochem (Tokyo) 137(2) Pages: 199-203
• [Journal Article] A novel role for Bsd2 in the resistance of yeast to adriamycin. (2005)
  • Author(s): Takahashi, Tsutomu
  • Journal Title: J Cell Physiol. 202(1) Pages: 100-104
• [Journal Article] Functions of yeast helicase Ssl2p that are essential for viability are also involved in protection from the toxicity of adriamycin (2004)
  • Author(s): Furuchi, Takemitsu
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 32(8) Pages: 2578-2585
• [Journal Article] L-Glutamate in the extracellular space regulates endogenous D-aspartate homeostasis in rat pheochromocytoma MPT1 cells (2004)
  • Author(s): Asachi, Minako
  • Journal Title: Arch Biochem Biophys. 424(1) Pages: 89-96
• [Journal Article] Overexpression of Ss12p confers resistance to adriamycin and actinomycin D in Saccharomyces cerevisiae. (2004)
  • Author(s): Furuchi, Takemitsu
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. 314(3) Pages: 844-848