マウス胃液及び胃粘膜上皮細胞におけるニトロソ化たん白質の網羅的解析

• Project/Area Number: 16790391
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Gastroenterology
• Research Institution: Josai University
• Principal Investigator: 大竹 一男 城西大学, 薬学部・病態解析学講座, 助手 (50337482)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000); Fiscal Year 2005: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 胃粘膜 / ニトロソ化たん白質 / 一酸化窒素 / 硝酸塩 / 亜硝酸塩 / プロテオーム / ニトロソ化たんぱく質

Research Abstract

一酸化窒素(NO)は、L-アルギニンからNO合成酵素(NOS)によって内因的に産生されるが、もう一つの経路として、野菜などに多量に含まれる硝酸塩や亜硝酸塩の摂取によって、外因的に胃内での酸性、還元的環境下で化学的にNOに変換され胃もしくは全身に供給される。胃におけるNOは、感染防御や局所血流の維持だけでなく、胃酸分泌、粘液分泌、重炭酸イオン分泌の制御等、胃の多彩な生理作用に非常に重要な役割を果たすことが知られている。加えて、NOは全身循環血液中において血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、抗アテローム性動脈硬化など血液循環動態の本質的役割を果たしていることも知られている。近年、シグナリング分子としてのNOの役割に関心が注がれてきている。特にカスパーゼ系酵素やある種のイオンチャネル、リアノジンレセプターなどの機能性たん白質は、その構造中のスルフホドリル基(-SH基)がNO関連物質(N_2O_3やニトロソニウムイオン)によってS-ニトロソ化(-SNO)され、その機能が変化すること、更に、たん白質のS-ニトロソ化反応は、翻訳後修飾の代表であるリン酸化反応と連動・拮抗しながら生体の恒常性の維持を担うことも推察されてきている。
そこで本研究では、上述した胃の様々な生理機能と上皮細胞におけるニトロソ化たん白質との関連性を評価するためのデータベースを構築するために(1)胃でのニトロソ化たん白質の検出(2)外因的NO供給源として亜硝酸塩をマウスに投与したときの胃粘膜ニトロソ化たん白質の質的、量的変化(3)胃粘膜ニトロソ化たん白質の分離並びにプロテオーム解析を行った。
その結果、(1)瞬間凍結剥離法によってマウス胃粘膜と筋層を分離し、胃粘膜ニトロソ化たん白質の検出を、Jaffreyら(Nat Cell Biol.3:193-7,2001)の報告したビオチンスイッチアッセイ(若干変更)にて検出できた。(2)本法を用いて、マウスに亜硝酸塩を経口投与させた後の胃粘膜ニトロソ化たん白質をウエスタンブロッティング法にて定量的に評価すると、亜硝酸塩の投与量に依存して180,80,38,32,4kDaの分子量のニトロソ化たん白質が顕著に増加することを示した。加えて、これら分子量以外のたん白質も亜硝酸塩の摂取量に依存してニトロソ化されることも示した。(3)これらニトロソ化たん白質を網羅的に同定するために、胃粘膜ライセートにNOドナーであるニトロソグルタチオン(GSNO)を加え、可能な限りニトロソ化した後、ビオチンスイッチアッセイにてニトロソ化たん白質を標識し、ストレプトアビジンゲルカラムにて精製した後、二次元電気泳動にて、ニトロソ化たん白質を分離した。その結果、GSNOを加えていないサンプルよりもGSNOを加えたサンプル方が、顕著に30以上のニトロソ化たん白質が銀染色法によって検出された。ゲルスポットを切り出し、脱色後、トリプシンにて酵素消化し、脱塩したサンプルをMALDI-TOF MASSにてフィンガーマスプリンティングを行った結果、現在までのところ、比較的量の多いハウスキーピングたん白質のみが同定できた。今後は、検出された全てのニトロソ化たん白質の同定を行うことが残されている。