アデノ随伴ウイルスベクターを用いた骨髄間葉系幹細胞から心筋細胞への再生

• Project/Area Number: 16790436
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Circulatory organs internal medicine
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 真鍋 知宏 慶應大, 医学部, 助手 (20327521)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2005: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2004: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: hTERT / アデノ随伴ウイルスベクター / 骨髄間葉系幹細胞 / 5-アザシチジン

Research Abstract

事前に慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認を得た上で、骨髄移植ドナーから骨髄血を採取する際にフィルターで除去される骨片を回収した。それをPBSで洗浄することにより骨片に付着残存していた細胞を回収した。この細胞をFACSにかけ、Sca-1(+),CD29(+),CD44(+),c-kit(+),CD105(+),CD45(-),CD31(-),cD34(-)の細胞集団を選別した。この細胞が骨髄間葉系幹細胞と考えられている。
一方、両方向性のCMVプロモーターを有するプラスミドにEGFPおよびhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)遺伝子を挿入し、遺伝子導入した細胞をEGFPをマーカーとして選別できるように作製した。このプラスミドをヘルパープラスミドとともにHEK293細胞に遺伝子導入した。この細胞を介して産生されるAAVベクターを回収した。
このAAVベクターを骨髄間葉系幹細胞に感染させ遺伝子導入した。EGFPをもとにFACSで選別を行い、hTERT遺伝子が導入された細胞のみを回収した。この操作により細胞の寿命が著明に延長することを確認した。
遺伝子導入した細胞に、以前CMG細胞で成功したときと同様に脱メチル化剤である5-アザシチジンを負荷して培養を行った。現時点では非常に低い効率であるものの、自己拍動を開始する細胞を認めている。他の薬剤を添加した条件での培養では拍動を開始する細胞は認めていない。これらのことからさらなる解析を行うレベルには達していないが、拍動を開始する細胞が散見されるので、細かい条件設定等の検討を行う必要がある。