新規筋関連転写因子GCF2-SKによる肝線維化治療の試み

• Project/Area Number: 16790771
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Digestive surgery
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 及川 昌也 東北大学, 病院, 助手 (30372296)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2005: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2004: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
• Keywords: 肝星細胞 / 筋関連転写因子

Research Abstract

ラット骨格筋cDNAからクローニングしたラットGCF2-SKについて、大腸菌発現により蛋白精製を試みた。当初His-tag融合蛋白発現ベクター(pTriEX3-rGCF2SK)を用い、BL21で蛋白発現させ、SDS-PAGEおよびanti-His抗体でのWestern blotにてHis融合蛋白発現を確認した。次いでカラム溶出での精製を試みたが、本法での精製効率が極めて不良であった。GXF2SKとHis-tagとの立体構造上の干渉などの可能性を考慮し、GST融合蛋白発現ベクターの作成、さらにGST-Hisのdouble tag発現ベクターを作成し、幾度もカラム溶出を試みたが満足の行く収量を得ることができなかった。それぞれともにSDS-PAGEでは蛋白合成が確認できることから、GSTもしくはHisによるトラップの段階に問題があると考えられたが、原因の詳細は不明である。発現蛋白での免疫による抗体作成を計画していたが、蛋白精製の段階に留まっている状態である。
NIH3T3細胞へのトランスフェクト実験では良好な発現が確認されていたので、GCF2SK-Neo^R polycistronic発現ベクターを用いて安定発現株の作成を行なったが、ベクターの特性にも関わらず、Neo耐性株でGCF2SKが発現していないという現象を経験した。ヒトGCF2SKの解析の際にも筋原性細胞にも関わらず平面培養系ではGCF2SK発現が弱くなることが確認されており、今後のラットGCF2SKの機能解析のためには3次元培養系を用いる必要があると考えられた。