NaF添加による骨細胞様細胞MLO-Y4におけるconnexine43の機能解析

• Project/Area Number: 16791295
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Orthodontic/Pediatric dentistry
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 島袋 鎮太郎 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (60337037)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2005: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 骨細胞様細胞(MLO-Y4) / フッ化ナトリウム / Gap Jnction / connexine43 / Photo breaching法 / Gap Junction / Connexine43

Research Abstract

本研究は骨細胞様細胞株MLO-Y4へのフッ化物を添加し、骨のホメオスターシスに重要な役割を担っているGap Junction蛋白connexine43の機能変化を解析することで、特にsiRNAを用いCX43をノックダウンさせた際の、MLO-Y4の増殖および構造の変化を検索することを目的としている。
細胞培養には、Type I collage-coated dishesにて、10% fetal bovine serumを含むα modified essential medium (αMEM)を用いた。フッ化物はNaFを用い、NaF濃度を0.1ppm,1ppm,10ppm,100ppmに調製し、細胞に添加した。Cx43のノックダウンの作製は、Ligationされた産物を、cloningし、siRNA Cx43 plasmidを作製し、MLO-Y4にtransfectionした。Cx43 siRNAプラスミドはMLO-Y4にトランスフェクションし、hygromycin Bを用いてstable cell lineを製作した。
Cx43機能解析に用いたPhoto breaching法は、無処理細胞およびNaF処理細胞をPBSで洗浄後、5-carboxy Fluorescein diacetate (7μg/ml) (Molecular Prosbe, USA)を添加し、30分間インキュベート後、多光子レーザー顕微鏡(BioRad, USA)によりPhoto breaching assayを行い、蛍光のリカバリーを検索中である。
現在までの結果として、骨細胞はフッ化物存在下で細胞間ネットワークが促進されることが示唆された。