無血清培養系での口腔癌患者由来活性化リンパ球からのiPS細胞の樹立とその治療応用

• Project/Area Number: 16H07003
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Surgical dentistry
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 赤木 恵理 広島大学, 病院(歯), 歯科診療医 (80778027)
• Project Period (FY): 2016-08-26 – 2018-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2017: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 末梢血由来単核球 / ヒトiPS細胞 / インテグレーションフリー / 無血清培養 / センダイウイルス / iPS細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件で誘導したヒトiPS細胞(hiPSC)を細胞傷害活性の高いリンパ球に再分化させ大量培養し、口腔癌の免疫細胞治療へ応用することを目的としている。本年度は、インテグレーションフリー・無フィーダー・無血清培養条件での末梢血単核球(PBMC)由来hiPSCの誘導法の効率化を検討した。口腔癌患者から採取したPBMCを、IL-2を添加した無血清培地RD5F(当研究室で開発)にて初代培養を行い増殖した活性化リンパ球にインテグレーションフリーのセンダイウイルスベクターSeVdpを用いて初期化4遺伝子を導入し、無血清培地hESF9(当研究室で開発)を用いてlaminin-E8上に播種しPBMC由来hiPSCを樹立した。更に効率よくhiPSCを誘導するために条件検討を行った。
①分離したPBMCを0、3、6日の各日数で初代培養しSeVdpに感染させた。
②SeVdp感染時のMOIを3、6、9の各種濃度とした。
③SeVdp感染後の細胞を100000、200000、500000 cells/wellの各密度で6wellプレート1wellに播種した。
これらの条件検討から、PBMCを6日間初代培養し、SeVdpをMOI6で感染させ、100000 cells/wellの密度で播種した条件が最も効率良くhiPSCを誘導できることが示された。さらに誘導されたPBMC由来hiPSCの未分化性の評価をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて検討した。誘導されたhiPSCは未分化マーカー遺伝子および蛋白発現を示した。また三胚葉への分化多能性をin vitroでは胚様体培養法を用い、in vivoではSCID mouseでのテラトーマ形成能を用いて評価したところ、いずれにおいても三胚葉への分化能を有していた。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。