進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発

• Project/Area Number: 16J01710
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Chemical biology
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 寺井 琢也 埼玉大学, 理工学研究科, 特別研究員(SPD) (00508145)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥11,700,000 (Direct Cost: ¥9,000,000、Indirect Cost: ¥2,700,000); Fiscal Year 2018: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2017: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2016: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
• Keywords: 進化分子工学 / ペプチド化学 / 蛍光センサー / 合成化学

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに確立したcDNA display技術を活用して、引き続き蛍光修飾ペプチドライブラリを使った「標的タンパク質に結合することで発光特性が変わる蛍光プローブ」および「プロテアーゼに対する特異的発蛍光基質」の開発を行った。
前者に関しては、各候補ペプチド配列の「蛍光変化」を直接検出可能なフローサイトメーター（FACS）評価系を利用した2段階セレクションシステムを立ち上げるため、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡを酵母発現用のプラスミドに導入し、酵母表面に候補ペプチドを発現させて蛍光修飾した。続いてFACSで個別の蛍光を測定・分取することによりセレクションを行った。しかし、細胞表面の内在性タンパク質の影響が予想より大きくＳ／Ｎの良いセレクションを実施する事は出来なかった。そこでマイクロビーズ表面にＤＮＡとペプチドを修飾する新たな系を構築することを試みた。種々の条件検討の結果、２種類のモデルＤＮＡを別々のビーズ上に結合させ、夫々に対応するペプチドを当該ビーズ上に固定して分取することに成功した。
また後者においては、プロテアーゼによって切断を受けたペプチド配列をセレクションするシステムの構築に前年度の研究で概ね成功している。そこで今年度は更に条件検討を進め、実際にランダムライブラリからの基質セレクションを行った。その結果、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して効率よく酵素反応を受けるペプチド配列を濃縮し、次世代シークエンス解析によって基質配列に関する知見を得ることができた。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] キュリー研究所/CNRS(フランス)
• [Journal Article] Selection of peptides that associate with dye-conjugated solid surfaces in a pH-dependent manner using cDNA display (2019)
  • Author(s): Takuya Terai, Hiroki Anzai, and Naoto Nemoto
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 4 Issue: 4 Pages: 7378-7384
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b00631
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia (2018)
  • Author(s): Hanaoka Kenjiro、Kagami Yu、Piao Wen、Myochin Takuya、Numasawa Koji、Kuriki Yugo、Ikeno Takayuki、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Terai Takuya、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 54 Issue: 50 Pages: 6939-6942
  • DOI: 10.1039/c8cc02451k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools to Measure pH Values in Living Samples (2018)
  • Author(s): Takahashi Shodai、Kagami Yu、Hanaoka Kenjiro、Terai Takuya、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Uchiyama Masanobu、Koyama-Honda Ikuko、Mizushima Noboru、Taguchi Tomohiko、Arai Hiroyuki、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 140 Issue: 18 Pages: 5925
  • DOI: 10.1021/jacs.8b00277
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Study to Select pH-dependent Phenolphthalein-Binding Peptide Aptamers by cDNA Display Method (2018)
  • Author(s): Hiroki Anzai, Takuya Terai, and Naoto Nemoto
  • Journal Title: Peptide Science Volume: 2017 Pages: 54-55
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A protein-coupled fluorescent probe for organelle-specific imaging of Na+ (2018)
  • Author(s): Ryo Taguchi, Takuya Terai, Tasuku Ueno, Toru Komatsu, Kenjiro Hanaoka, and Yasuteru Urano
  • Journal Title: Sensor Actuat. B－Chem. Volume: 265 Pages: 575-581
  • DOI: 10.1016/j.snb.2018.03.090
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of an Azo-Based Photosensitizer Activated under Mild Hypoxia for Photodynamic Therapy (2017)
  • Author(s): Piao Wen、Hanaoka Kenjiro、Fujisawa Tomotsumi、Takeuchi Satoshi、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Terai Takuya、Tahara Tahei、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: J. Am. Chem. Soc. Volume: 139 Issue: 39 Pages: 13713-13719
  • DOI: 10.1021/jacs.7b05019
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Synthesis of Practical Red Fluorescent Probe for Cytoplasmic Calcium Ions with Greatly Improved Cell-membrane Permeability (2017)
  • Author(s): Kazuhisa Hirabayashi, Kenjiro Hanaoka, Takahiro Egawa, Chiaki Kobayashi, Shodai Takahashi, Toru Komatsu, Tasuku Ueno, Takuya Terai, Yuji Ikegaya, Tetsuo Nagano, Yasuteru Urano
  • Journal Title: Data in Brief Volume: 12 Pages: 351-357
  • DOI: 10.1016/j.dib.2017.04.011
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro Selection of Random Peptides against Artificial Lipid Bilayers: A Potential Tool to Immobilize Molecules on Membranes (2017)
  • Author(s): Shota Kobayashi, Takuya Terai, Yuki Yoshikawa, Ryoya Ohkawa, Mika Ebihara, Masahito Hayashi, Kingo Takiguchi, and Naoto Nemoto
  • Journal Title: Chem Commun (Camb) Volume: 53 Issue: 24 Pages: 3458-3461
  • DOI: 10.1039/c7cc00099e
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Enhanced mRNA-protein fusion efficiency of a single-domain antibody by selection of mRNA display with additional random sequences in the terminal translated regions (2017)
  • Author(s): Kazuki Takahashi, Masato Sunohara, Takuya Terai, Shigefumi Kumachi and Naoto Nemoto
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 14 Issue: 0 Pages: 23-28
  • DOI: 10.2142/biophysico.14.0_23
  • NAID: 130005396150
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Improving The Solubility of Artificial Ligands of Streptavidin to Enable More Practical Reversible Switching of Protein Localization in Cells (2017)
  • Author(s): Ryo Tachibana, Takuya Terai, Gaelle Boncompain, Shigeru Sugiyama, Nae Saito, Franck Perez and Yasuteru Urano
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 18 Issue: 4 Pages: 358-362
  • DOI: 10.1002/cbic.201600640
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] cDNA display法を用いた夾雑環境下での試験管内淘汰 (2019)
  • Author(s): 安齋 宏紀、根本 直人、寺井 琢也
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] In vitro selection of peptide aptamers that recognize a specific conformation of an organic dye (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] 進化分子工学による低分子認識ポリペプチドの開発 (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: Future Trend in Polymer Science 2018
• [Presentation] pH応答型タンパク質精製システムを目指した低分子結合ペプチドの探索研究 (2018)
  • Author(s): 山田 陸、安齋 宏紀、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] cDNA display法を用いたプロテアーゼの基質探査法の開発 (2018)
  • Author(s): 藤谷 聡、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Development of Phenolphthalein Binding Peptide Aptamers Using cDNA Display (2018)
  • Author(s): Hiroki Anzai, Riku Yamada, Takuya Terai, Naoto Nemoto
  • Organizer: 10th International Peptide Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] cDNA display法によるペプチドスクリーニングの最前線 (2017)
  • Author(s): 寺井琢也、安齋宏紀、小林省太、吉川祐紀、蛯原三華、根本 直人
  • Organizer: 日本化学工学会 第49回秋季大会
• [Presentation] 進化分子工学を用いた有機小分子の構造変化を認識するペプチドアプタマーの開発 (2017)
  • Author(s): 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • Organizer: 第11回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Phenolphthalein binding peptide aptamers by in vitro selection using complementary DNA display (2017)
  • Author(s): 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • Organizer: 第54回ペプチド討論会
• [Presentation] 合成繊維（ナイロン）を分解する人工ペプチド酵素の創生 (2016)
  • Author(s): 照井直樹、寺井琢也、根本直人
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] ゲルシフトセレクションによるシングルドメイン抗体（VHH）のmRNA-タンパク質複合体形成効率の向上 (2016)
  • Author(s): 春原聖人、高橋一貴、寺井琢也、熊地重文、根本直人
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] リポソーム結合ペプチド LB-1を用いた脂質二重膜表面へのタンパク質提示手法の開発 (2016)
  • Author(s): 寺井琢也、蛯原三華、大川僚也、小林省太、吉川祐紀、根本直人
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] 構造解析に基づく新規streptavidin結合分子の開発 (2016)
  • Author(s): 藤掛椋、寺井琢也、杉山成、浦野泰照
  • Organizer: 第１６回東京大学生命科学シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都目黒区）
• [Book] ペプチド医薬品のスクリーニング・安定化・製剤化技術 (2017)
  • Author(s): 寺井琢也、熊地重文、根本直人
  • Total Pages: 557
  • Publisher: 技術情報協会
• [Remarks] 埼玉大学工学部応用化学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [Remarks] 東京大学薬学部薬品代謝化学教室ホームページ
  • URL: http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~taisha/
• [Remarks] 埼玉大学工学部機能材料工学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2018)
  • Inventor(s): 根本直人、寺井琢也、安齋宏紀、山田陸
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2018-162831
  • Filing Date: 2018
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2017)
  • Inventor(s): 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • Industrial Property Rights Holder: (株)Epsilon Molecular Engineering
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2017-167056
  • Filing Date: 2017