がん細胞由来エクソソームの中枢との相互作用メカニズムの解明

• Project/Area Number: 16J02928
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied pharmacology
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 黒田 広樹 東北大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2018: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2017: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2016: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: エクソソーム / 血液脳関門 / CD46 / がん細胞 / 接着分子 / 受容体 / 架橋剤 / 網羅的プロテオミクス / SWATH法

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではエクソソームが血液脳関門を透過する分子機構の解明を目標としている。前年度は、脳転移性メラノーマ細胞株SK-Mel-28由来エクソソームが、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞へ内在化する過程で、ウイルス受容体CD46が高い寄与を有する可能性を示した。今年度は、CD46のバリデーションを進めるとともに、血液脳関門透過性の高いエクソソームを明らかにすることを目的とした。
前年度CD46に対するsiRNA処理で、エクソソーム内在化活性が低下したことに関して、CD46の発現量が低下しているかを検証した。定量PCR及び免疫染色の結果、CD46のmRNA及びタンパク質発現量はコントロールsiRNAを処理したhCMEC/D3細胞に比較して顕著に91、38%低下した。これらの結果から、hCMEC/D3細胞におけるCD46が、SK-Mel-28細胞由来のエクソソームの内在化に寄与することが示唆された。ヒト脳切片を用いた免疫染色の結果、CD46の蛍光は内皮細胞マーカーであるGLUT1に一致した。従って、CD46がin vivoにおいても脳毛細血管内皮細胞において発現し、エクソソーム受容体として機能する可能性が示された。
次に、エクソソームの血液脳関門透過性を検証するため、hCMEC/D3細胞をトランスウェルに培養してin vitroトランスサイトーシス実験を行った。過去に脳毛細血管内皮細胞株由来のエクソソームが高い血液脳関門透過性を示した報告からhCMEC/D3細胞由来エクソソームの移行性を評価した結果、SK-Mel-28細胞由来エクソソームと比較して2倍高い移行能が示され、これらのエクソソームに発現する分子を比較することで、透過性を決定する因子を同定できる可能性が示された。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Cluster of Differentiation 46 is the Major Receptor in Human Blood-Brain Barrier Endothelial Cells for Uptake of Exosomes Derived from Brain-Metastatic Melanoma Cells (SK-Mel-28) (2019)
  • Author(s): Kuroda H, Tachikawa M, Yagi Y, Umetsu M, Nurdin A, Miyauchi E, Watanabe M, Uchida Y, Terasaki T.
  • Journal Title: Mol. Pharm. Volume: 16 Issue: 1 Pages: 292-304
  • DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00985
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Sulfo-SBED/SWATHプロテオミクスを用いたヒト血液脳関門モデルhCMEC/D3細胞におけるエクソソーム受容体の同定 (2018)
  • Author(s): 黒田 広樹, 立川 正憲, 八木 悠太, 内田 康雄, 寺崎 哲也
  • Organizer: 第40回 生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
• [Presentation] Sulfo-SBED/SWATH proteomics-based identification of RGD receptor integrins as the receptors for SK-Mel-28-derived exosomes internalization into human blood-brain barrier hCMEC/D3 cells. (2018)
  • Author(s): Hiroki Kuroda, Masanori Tachikawa, Yasuo Uchida amd Tetsuya Terasaki
  • Organizer: Gordon Research Conference 2018, Barriers of the CNS
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒト血液脳関門モデル hCMEC/D3 細胞における脳転移性メラノーマ細胞由来 exosome 内在化に関与する受容体の同定 (2017)
  • Author(s): 黒田広樹, 立川 正憲, 内田 康雄, 寺崎 哲也
  • Organizer: 日本薬学会137年会
  • Place of Presentation: sendai, Japan
  • Year and Date: 2017-03-26
• [Presentation] Identification of RGD receptor integrins as the receptor proteins for the internalization of brain metastatic melanoma-derived exosomes in human blood-brain barrier hCMEC/D3 cells. (2017)
  • Author(s): Hiroki Kuroda, Masanori Tachikawa, Yuta Yagi, Yasuo Uchida and Tetsuya Terasaki
  • Organizer: The Academy of Pharaceutical Science and Technology, Japan Global Education Seminar 2017-1st
• [Presentation] RGD receptor integrins are involved for transport of brain metastatic melanoma SK-Mel-28 cells-derived exosomes into human blood-brain barrier hCMEC/D3 cells. (2017)
  • Author(s): Hiroki Kuroda, Masanori Tachikawa, Yuta Yagi, Yasuo Uchida and Tetsuya Terasaki
  • Organizer: 12th INTERNATIONAL CONFERENCE on CEREBRAL VASCULAR BIOLOGY MELBOURNE 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of blood-brain barrier membrane protein interacting with exosome derived from breast cancer cell line (MCF-7) in human (2016)
  • Author(s): Hiroki Kuroda, Masanori Tachikawa and Tetsuya Terasaki
  • Organizer: The Globalization of Pharmaceutics Education Network (GPEN) 2016
  • Place of Presentation: Kansas, U.S.
  • Year and Date: 2016-11-11
  • Int'l Joint Research