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ゲノム編集技術を用いた簡便・正確・高効率なSNP改変法の開発

Research Project

Project/Area Number 16J03164
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field System genome science
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

中出 翔太  広島大学, 理学研究科, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2016-04-22 – 2018-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2016: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywordsゲノム編集法 / SNP / MMEJ / EXO1
Outline of Annual Research Achievements

本年度は、高効率かつ正確性の高い新規SNP改変技術の確立に先立つ技術基盤について整備するために、以下の通り研究を実施した。本研究の新規SNP改変法は、ゲノム上の任意の配列を切断できる人工ヌクレアーゼとマイクロホモロジー媒介末端結合(Microhomology mediated end joining: MMEJ)修復を利用することによって高効率かつ簡便にSNP改変を導入する。MMEJは、DNAの二本鎖切断(Double Strand Break: DSB)を修復する経路の一つだが、その効率については活性化できる余地が残っていた。そこで本研究では、ヒト培養細胞においてMMEJ修復の関連遺伝子を過剰発現することによって、MMEJ修復に関連した遺伝子改変技術の高効率化を実現した。
まず、ヒト培養細胞を用いたレポーターアッセイを用いてMMEJ修復を活性化する遺伝子についてDSB修復に関連すると考えられる10以上の遺伝子をスクリーニングした結果、EXO1がMMEJ修復効率を約2倍活性化することが明らかになった。
さらに、EXO1の過剰発現によるMMEJ修復経路の活性化を通じて、遺伝子改変技術の効率が上昇することを確認した。本研究室では、既にMMEJ修復を利用した簡便かつ汎用性の高いノックイン法について発表していたため(PITCh法)、EXO1の過剰発現によって同法が高効率化することを証明した。結果として、ヒト培養細胞へのPITCh法の適用時にEXO1を過剰発現させると、ノックイン効率がおよそ1.5倍上昇することが分かった。本研究によって確立された高効率化技術に関しては、2016年11月にBMC genomics第17巻1号に論文として掲載された。
この手法の開発によって、MMEJ修復を利用した新規SNP法の基盤整備を完了したため、今後本法のSNP改変への応用を進める計画である。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Report

(1 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • Research Products

    (4 results)

All 2017 2016

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Cpf1 and C2c1/2/3―What's next?2017

    • Author(s)
      Shota Nakade, Takashi Yamamoto, Tetsushi Sakuma.
    • Journal Title

      Bioengineered

      Volume: - Issue: 3 Pages: 265-273

    • DOI

      10.1080/21655979.2017.1282018

    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Gene cassette knock-in in mammalian cells and zygotes by enhanced MMEJ.2016

    • Author(s)
      Aida T, Nakade S, Sakuma T, Izu Y, Oishi A, Mochida K, Ishikubo H, Usami T, Aizawa H, Yamamoto T, Tanaka K.
    • Journal Title

      BMC Genomics

      Volume: 17 Issue: 1 Pages: 979-979

    • DOI

      10.1186/s12864-016-3331-9

    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Improved method for PITCh-based knock-in with MMEJ pathway activation in human cells2017

    • Author(s)
      Shota Nakade, Tetsushi Sakuma, Takashi Yamamoto
    • Organizer
      Precision Genome Engineering - keystone symposia
    • Place of Presentation
      Breckenridge, Colorado USA
    • Year and Date
      2017-01-10
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] MMEJ修復経路の活性化によるヒト培養細胞での遺伝子ノックインの効率化2016

    • Author(s)
      中出翔太、大石鮎、持田圭次、佐久間哲史、山本卓
    • Organizer
      第39回 日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2016-11-30
    • Related Report
      2016 Annual Research Report

URL: 

Published: 2016-05-17   Modified: 2024-03-26  

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