新規ＧａｌＮＡｃ特異的グリコシダーゼの立体構造に基づくオリゴ糖の合成と機能性開拓

• Project/Area Number: 16J03683
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 佐藤 真与 (2016-2017) 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Research Fellow: 佐藤 真与 (2018) 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2018: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2017: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2016: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: ビフィズス菌 / X線結晶構造解析 / 糖代謝酵素 / 糖質関連酵素 / X戦結晶構造解析 / 腸内細菌 / 構造生物学 / 酵素学

Outline of Annual Research Achievements

GalTBlについては、前年度までで大まかな全体構造は得られていたが、活性中心に関しては不明瞭な電子密度のデータしか得られていなかった。様々な結晶化条件を検討し、基質の1つであるUDP-ガラクトースの存在の下で結晶化を行った結晶のデータセットの取得に成功した。糖の電子密度は不明瞭であったが、UDPのαリン酸に関しては比較的強い電子密度が見られた。この構造により、酵素の基質認識に関する示唆が得られた。これを元に、周囲の残基のAla変異体を12種作製した。これらについて活性測定を行い、ほぼ全ての変異体で活性が著しく低下したことにより、これらの残基が触媒反応に関わっている可能性が極めて高いことが示された。さらに野生型GalTBlについて、酵素学的パラメータを算出した。Gal1Pに対するKmが2.56 mMであるのに対し、GalNAc1Pに対するKmが0.0492 mMと、約50倍高い親和性を示すことが分かった。この結果は、GalTBlがGalNAc1Pを基質とするように適応していることを示しており、N-アセチル基およびその認識が同種のGalTを保有するビフィズス菌の資化において非常に重要であることを示すものとなった。

SiaBb3のβ-GalNAcaseドメインに関しては結晶化が難しく、結晶を形成する条件を見出すことはできなかった。Sialidaseドメインに関しては結晶化に成功し、2.5 A程度の分解能を示すデータセットの取得に成功した。しかし、分子置換によっては構造決定は難しく、位相決定が必要なことが明らかになった。今後引き継がれて構造決定に至ることが期待される。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 西オーストラリア大学(オーストラリア)
• [Journal Article] The First Crystal Structure of a Family 129 Glycoside Hydrolase from a Probiotic Bacterium Reveals Critical Residues and Metal Co-factors (2017)
  • Author(s): Mayo Sato, Dorothee Liebschner, Yusuke Yamada, Naohiro Matsugaki, Takatoshi Arakawa, Siobhan S. Wills, Mitchell Hattie, Keith A. Stubbs, Tasuku Ito, Toshiya Senda, Hisashi Ashida and Shinya Fushinobu
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 292 Issue: 29 Pages: 12126-12138
  • DOI: 10.1074/jbc.m117.777391
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの金属結合サイトと阻害剤を用いた解析 (2017)
  • Author(s): 佐藤真与、Dorothee Liebschner、山田悠介、松垣直宏、千田俊哉、荒川孝俊、芦田久、伏信進矢
  • Organizer: 農芸化学会
  • Place of Presentation: 京都女子大学（京都府 京都市）
  • Year and Date: 2017-03-17
• [Presentation] ビフィズス菌由来N-アセチルヘキソサミン 1-キナーゼの立体構造とオリゴ糖合成に向けた改変 (2017)
  • Author(s): 佐藤真与、荒川孝俊、西本完、北岡本光、伏信進矢
  • Organizer: 平成29年度酪農科学シンポジウム
• [Presentation] Crystal structure of glycoside hydrolase family 129 α-N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium bifidum (2017)
  • Author(s): Mayo Sato, Dorothee Liebschner, Yusuke Yamada, Naohiro Matsugaki, Takatoshi Arakawa, Toshiya Senda, Hisashi Ashida, and Shinya Fushinobu
  • Organizer: 12th Carbohydrate Bioengineering Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] GH129ファミリーα-N-アセチルガラクトサミニダーゼのX線結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 佐藤真与、Dorothee Liebschner、荒川孝俊、山田悠介、千田俊哉、芦田久、伏信進矢
  • Organizer: 応用糖質科学会
  • Place of Presentation: 学校法人福山大学宮地茂記念館（広島県 福山市）
  • Year and Date: 2016-09-14