ルール抽出の指向的進化サイクルによるがん治療低分子抗体の創出

• Project/Area Number: 16J04866
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Biofunction/Bioprocess
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 杉山 在生人 東北大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2017: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2016: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 蛋白質工学 / 抗体工学 / スクリーニング / 進化工学的手法 / がん治療 / 二重特異性抗体

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、高い薬効を有するがん治療抗体を効率的、かつ確実に取得する手法を開発し、薬効発現の必要条件を抽出しながら高薬効抗体を設計していく方法論の提案を目標としている。本年度は、これまでの研究により確立した利便性の高い低分子抗体スクリーニング系にファージ提示法を使った進化工学的手法を組み合わせることで従来手法よりも高い効率で有望クローンを取得することに成功した(1)．また，低分子抗体であるディアボディのリンパ球活性化度を評価する手法の確立に成功し，かつ，標的分子に対する結合活性，および細胞傷害活性とリンパ球活性化能力に相関があることを見出した(2)．

具体的には，1. Her2に対する結合性抗体をM13ファージウイルスに提示させ，バイオパニングによって取得することに成功した．本バイオパニングには，昨年度作製した乳癌等で過剰発現が認められるHER2の細胞外領域の全長、細胞外領域の１ドメイン、ペプチド鎖のサイズの異なる各HER2断片を標的分子として利用した．実際に取得した結合性抗体はHer2特異的に結合することがわかった．さらに取得されたHer2結合性抗体とがん細胞に過剰発現するEGFRに対する結合性抗体から二重特異性抗体を構築し，大腸菌にて発現，精製したところ，この二重特異性抗体はHer2陽性細胞に対して高い細胞傷害活性を示し，その有効性を証明することができた．
2.ディアボディは結合価数が１であるため，がん細胞の非存在下ではリンパ球を活性化せず，がん細胞とリンパ球がいずれも存在するときのみディアボディのリンパ球活性化能が発現することがわかった．また，リンパ球に対する結合活性が向上してもディアボディのリンパ球活性化能には寄与しなかったのに対し，がん細胞に対する結合活性の向上はリンパ球活性化能を向上させることが明らかになった．

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] High-throughput cytotoxicity and antigen-binding assay for screening small bispecific antibodies without purification (2018)
  • Author(s): Sugiyama Aruto、Umetsu Mitsuo、Nakazawa Hikaru、Niide Teppei、Asano Ryutaro、Hattori Takamitsu、Kumagai Izumi
  • Journal Title: JBB Volume: - Issue: 2 Pages: 31237-31239
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.02.007
  • NAID: 40021645320
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of camelid VHH bispecific constructs via in-cell intein-mediated protein trans-splicing (2017)
  • Author(s): Yuki Shibuya, Natsuki Haga, Ryutaro Asano, Hikaru Nakazawa, Takamitsu Hattori, Daisuke Takeda Aruto Sugiyama, Reiko Kurotani, Izumi Kumagai, Mitsuo Umetsu, Koki Makabe
  • Journal Title: Protein Engineering, Design & Selection Volume: 30 Pages: 15-21
  • DOI: 10.1093/protein/gzw057
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A semi high-throughput method for screening small bispecific antibodies with high cytotoxicity (2017)
  • Author(s): Aruto Sugiyama, Mitsuo Umetsu, Hikaru Nakazawa, Teppei Niide, Tomoko Onodera, Katsuhiro Hosokawa, Shuhei Hattori, Ryutaro Asano, Izumi Kumagai
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: -
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 高薬効な二重特異性抗体スクリーニングの高度化を目指したリンパ球活性化能の評価系検討 (2017)
  • Author(s): ○杉山在生人, 梅津光央, 中澤光, 熊谷泉
  • Organizer: 第17回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] What are the Rules for Designing Small Antibodies with High Cytotoxicity (2017)
  • Author(s): ○Aruto Sugiyama, Mitsuo Umetsu, Hikaru Nakazawa, Ryutaro Asano, Teppei Niide and Izumi Kumagai
  • Organizer: ACB 2017 (The 13th Asian Congress on Biotechnology 2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] high-throughput method screening of small bispecific antibody for cancer therapy (2017)
  • Author(s): ○Aruto Sugiyama, Mitsuo Umetsu, Hikaru Nakazawa, Ryutaro Asano, Teppei Niide and Izumi Kumagai
  • Organizer: ICONAN (International Conference on Nanomedicine and Nanobiotechnology)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Can all Bispecific Antibodies Activate T-lymphocyte (2017)
  • Author(s): ○Aruto Sugiyama, Manon Wayere, Hikaru Nakazawa, Mitsuo Umetsu and Izumi Kumagai
  • Organizer: IMETI (The Sixth International Multi-Conference on Engineering and Technology Innovation 2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Simple quantitative cytotoxicity & binding screening process of recombinant antibody library (2016)
  • Author(s): Aruto Sugiyama, Mitsuo Umetsu, Hikaru Nakazawa, Ryutaro Asano, Teppei Nide, Takamitsu Hattori, and Izumi Kumagai
  • Organizer: Campus Asia Summer School 2016
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 精製プロセスを伴わない低分子抗体の定量的薬効・蛋白質間相互作用スクリーニング (2016)
  • Author(s): 杉山在生人, 梅津光央, 中澤光, 浅野竜太郎, 二井手哲平, 服部峰充, 熊谷泉
  • Organizer: 第68回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 富山国際会議場（富山県・富山市）
  • Year and Date: 2016-08-30
• [Presentation] 大腸菌の培養上清を用いた定量的な薬効・蛋白質間相互作用スクリーニングプロセスの開発 (2016)
  • Author(s): 杉山在生人, 梅津光央, 中澤光, 二井手哲平, 服部峰充, 熊谷泉
  • Organizer: 生物工学会若手会夏のセミナー
  • Place of Presentation: ホテルコンチネンタル府中（東京都・府中市）
  • Year and Date: 2016-07-16
• [Presentation] Quantitative screening for highly cytotoxic bispecific antibody without purification process (2016)
  • Author(s): Aruto Sugiyama, Hikaru Nakazawa, Ryutaro Asano, Teppei Niide, Izumi Kumagai and Mitsuo Umetsu
  • Organizer: Protein Therapeutics Summit
  • Place of Presentation: San Francisco, CA., USA
  • Year and Date: 2016-06-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ELISA法との組合せによる未精製抗体の定量的薬効・蛋白質間相互作用スクリーニング (2016)
  • Author(s): 杉山在生人, 梅津光央, 中澤光,浅野竜太郎, 二井手哲平, 服部峰充, 熊谷泉
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-08
• [Patent(Industrial Property Rights)] 抗体断片及び該抗体を含む二重特異性抗体 (2018)
  • Inventor(s): 梅津光央,杉山在生人,中澤光,二井手哲平,岸本英博,村上明一
  • Industrial Property Rights Holder: 梅津光央,杉山在生人,中澤光,二井手哲平,岸本英博,村上明一
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2018-075339
  • Filing Date: 2018
• [Patent(Industrial Property Rights)] がん治療を目的とした二重特異性抗体の製造方法 (2017)
  • Inventor(s): 中村泰之,藍川晋平,近藤昭彦,梅津光央,中澤光,杉山 在生人ほか
  • Industrial Property Rights Holder: 中村泰之,藍川晋平,近藤昭彦,梅津光央,中澤光,杉山 在生人ほか
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2017-237252
  • Filing Date: 2017