単一細胞の経時的な解析が解き明かす、初期発生における未分化と分化の切り替え機構

• Project/Area Number: 16J08005
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Developmental biology
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 中能 祥太 基礎生物学研究所, 初期発生研究部門, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2017: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ヒト多能性細胞 / 細胞周期 / シグナル伝達経路 / 多能性 / 分化 / CRISPR/Cas9 / pOPTiKD / Erk / Stat3 / 細胞周期制御因子 / マウス初期胚 / 自動検出アルゴリズム

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、シグナル経路と細胞周期制御因子に注目して、哺乳類の初期発生において多能性と分化を制御する機構への理解を深めることを目指す。最終年度である2018年度は、2017年度と同様に共同研究先であるイギリス・ケンブリッジ大学の研究室に滞在し、ヒト多能性幹細胞を用いたin vitroの実験系によって研究を進めた。
前年度に樹立したdouble knock outヒトES細胞に、誘導型knock downの遺伝子カセットを導入することで、細胞周期を制御する遺伝子ファミリーの3つを同時に欠損させる細胞株を作製した。この細胞株を用いた表現型試験の結果、対象の遺伝子ファミリーが多能性の維持に必須ではないことが示唆された。この結果は初めの仮説とは異なるものの、in vitro分化の系を使ったさらなる検証の結果、内胚葉への分化において対象の遺伝子ファミリーが重要な役割を果たしていることが示唆された。これらの遺伝子の欠損が、多能性の維持ではなく、細胞分化にのみ影響することは興味深い。標的遺伝子が特定の細胞系統への分化に関与する仕組みを予測するために、RNA-seqを行なっている。また、shRNAに基づく誘導型knock downのシステムを利用して、シグナル経路の構成因子をピンポイントに阻害する細胞株の樹立にも成功した。これらの細胞株と網羅的な解析を組み合わせた解析を進めている。
以上より、これまでわかっていなかったヒト初期胚の多能性状態の新たな側面を示す興味深い知見が得られた。今後は学術振興会の海外特別研究員として同留学先において研究を進め、本研究成果を含めた論文を発表したいと考えている。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Professor Ludovic Vallier/Anne Mc. Lab/University of Cambridge(英国)
• [Int'l Joint Research] University of Cambridge(United Kingdom)
• [Int'l Joint Research] University of Cambridge(United Kingdom)
• [Journal Article] Method to Synchronize Cell Cycle of Human Pluripotent Stem Cells without Affecting Their Fundamental Characteristics (2019)
  • Author(s): Loukia Yiangou, Rodrigo Grandy, Carola Morell, Rute Tomaz, Anna Osnato, Juned Kadiwala, Daniele Muraro, Jose Garcia-Bernardo, Shota Nakanoh, William Bernard, Daniel Ortmann, Davis McCarthy, Ingrid Simonic, Sanjay Sinha, Ludovic Vallier
  • Journal Title: Stem Cell Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 165-179
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2018.11.020
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The SMAD2/3 interactome reveals that TGFβ controls m6A mRNA methylation in pluripotency (2018)
  • Author(s): Bertero Alessandro、Brown Stephanie、Madrigal Pedro、Osnato Anna、Ortmann Daniel、Yiangou Loukia、Kadiwala Juned、Hubner Nina C.、de los Mozos Igor Ruiz、Sadee Christoph、Lenaerts An-Sofie、Nakanoh Shota、Grandy Rodrigo、Farnell Edward、Ule Jernej、Stunnenberg Hendrik G.、Mendjan Sasha、Vallier Ludovic
  • Journal Title: Nature Volume: 555 Issue: 7695 Pages: 256-259
  • DOI: 10.1038/nature25784
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Jak1/Stat3 signaling acts as a positive regulator of pluripotency in chicken pre-gastrula embryos (2017)
  • Author(s): Shota Nakanoh, Naoyuki Fuse, Ryosuke Tadokoro, Yoshiko Takahashi and Kiyokazu Agata
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: 421 Issue: 1 Pages: 43-51
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2016.11.001
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Cell cycle regulators control pluripotency of human embryonic stem cells (2018)
  • Author(s): Shota Nakanoh, Juned Kadiwala, An-Sofie Lanaerts and Ludovic Vallier
  • Organizer: From stem cells to human development, Cell cycle regulators control pluripotency of human embryonic stem cells
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Pluripotent states are regulated by Jak/Stat and Fgf/Erk signalings in chicken blastoderms (2016)
  • Author(s): 中能祥太
  • Organizer: 日本発生生物学会 第49回年会 熊本学会
  • Place of Presentation: 熊本県熊本市熊本市民会館
  • Year and Date: 2016-05-31
  • Int'l Joint Research