出血性ではなく逆に血栓性素因となる凝固因子異常症の分子病態解析とその検出法の開発

• Project/Area Number: 16J08029
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Laboratory medicine
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高木 夕希 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2017: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2016: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: アンチトロンビン抵抗性 / 静脈血栓症 / トロンボモジュリン抵抗性

Outline of Annual Research Achievements

原因不明の静脈血栓症発症要因究明と個々に最適な抗血栓薬選択を目指し、凝固因子異常症の分子病態解析と検出法開発を目的とした。平成29年度は活性化凝固第X因子(FXa)の不活化動態解析法の開発を中心に研究した。精製ヒト凝固第X因子(FX)を検体とし、FXaのアンチトロンビン抵抗性解析法を設定した。FXのアクチベーターにはリコンビナント活性化凝固第VII因子と組織因子の混液を使用し、FX活性化に指摘な各因子の濃度と活性化時間を決定した。十分に活性化されたFXaの不活化動態の観察に最適なヒト精製アンチトロンビンの添加濃度を決定した。残存したFXaの検出には発色性合成基質S-2222を用いた。平成28年度に樹立した野生型／各変異型FX発現ベクターを培養細胞に導入後、薬剤耐性およびウエスタンブロッティング解析による選択を行い野生型／変異型FX安定過剰発現細胞を樹立した。野生型／変異型FX安定過剰発現細胞の培養上清を限外濾過にて濃縮後、ELISA法にてFX抗原量を測定したものを組換え型野生型／変異型FXとした。
最適化したFXaのアンチトロンビン抵抗性解析法にて、組換え型野生型／変異型FXのアンチトロンビン感受性を評価した。FX Arg372ミスセンス変異体は372Pro変異体を除いて予想通りアンチトロンビン抵抗性を示した。アンチトロンビン抵抗性を示すFX Arg372ミスセンス変異体の活性体は、野生型FXaよりも凝固活性を長時間持続させるために血栓症の原因となりうると推測された。また、アンチトロンビン抵抗性の程度は、遺伝子変異により置換したアミノ酸の位置だけでなく、置換したアミノ酸の性質にも依存することが示唆された。この結果は現在原因不明の静脈血栓症患者の中にFXのアンチトロンビン抵抗性患者が潜在している可能性を示唆するものである。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Missense mutations in the gene encoding prothrombin corresponding to Arg596 cause antithrombin resistance and thrombomodulin resistance (2016)
  • Author(s): Takagi Y, Murata M, Kozuka T, Nakata Y, Hasebe R, Tamura S, Takagi A, Matsushita T, Saito H, Kojima T.
  • Journal Title: THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS Volume: 116 Issue: 12 Pages: 1022-31
  • DOI: 10.1160/th16-03-0223
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] プロトロンビンArg596ミスセンス変異がトロンビンのトロンボモジュリン結合能に及ぼす影響 (2016)
  • Author(s): 高木夕希, 鈴木幸子, 河村奈美, 槇山愛弓, 橋本恵梨華, 坂根寛人, 藤岡亮也, 田村彰吾, 高木明, 小嶋哲人
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2016-11-30
• [Presentation] Prothrombin missense mutations at 596Arg reduced the affinity of mutant thrombin to thrombomodulin controlled by Na+ concentration. (2016)
  • Author(s): Takagi Y, Kawamura N, Makiyama A, Hashimoto E, Tamura S, Takagi A, Kojima T.
  • Organizer: 第29回国際検査血液学会シンポジウム
  • Place of Presentation: イタリア、ミラノ
  • Year and Date: 2016-05-12
  • Int'l Joint Research