熱応答性磁性ナノ粒子を用いたクリプトスポリジウム遺伝子の高感度検出法の開発

• Project/Area Number: 16K06553
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Civil and environmental engineering
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 関川 貴寛 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (20511728)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2018-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2018: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2017: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: クリプトスポリジウム / 界面活性剤抽出処理 / 熱応答性高分子 / 磁性ナノ粒子 / 免疫磁気分離 / 核酸抽出 / リアルタイムPCR / オーシスト / 界面活性剤 / 免疫磁気ビーズ

Outline of Annual Research Achievements

我々はアビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子（Thermoresponsive magnetic nanoparticle: TMNP）とCryptosporidium parvumに特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてオーシスト回収用の熱応答性免疫磁性ナノ粒子（Thermoresponsive immunomagnetic nanoparticle: TIMNP）を開発した。また、クリプトスポリジウムのオーシストから核酸を抽出する界面活性剤抽出処理（Surfactant extraction treatment: SET）とTIMNPの併用法（TIMNP-SET法）を用いたオーシスト18S rDNAの検出に成功している。平成29年度は、TIMNP-SET法を用いて河川水からのC. paruvumオーシストの回収およびDNAの検出条件を検討した。オーシストDNAの検出には、クリプトスポリジウム18S rDNAに特異的なプライマーセットとTaqManプローブを用いた。TIMNPの粒子濃度は4 mg/mLに調整した。C. parvum DNAとTIMNPを含む試料水に陰イオン界面活性剤SDS（終濃度0.1％）を添加した後、加熱処理（90℃、15分間）で核酸を抽出し、加熱処理後のTIMNPがリアルタイムPCRに及ぼす影響を評価した。その結果、TIMNP濃度1％由来のPCR阻害はTween20添加では抑制されないが、SDS処理のみで抑制されることがわかった。また、蒸留水750 μL にオーシスト100000個を添加してクリプトスポリジウム汚染水を調製し、TIMNP-SET法を用いてオーシストの回収およびリアルタイムPCR法によるDNAの検出感度を評価した。その結果、PCR試薬中のTIMNP濃度が1％でもPCR阻害が抑制され、オーシスト由来DNAを高感度に検出できることが確認された。

Research Products

• [Presentation] Development of thermo-responsive magnetic nanoparticles for Cryptosporidium oocyst recovery (2017)
  • Author(s): Sekikawa T., Ohnishi N., Xie X.
  • Organizer: Applied Nanotechnology and Nanoscience International Conference 2017
  • Place of Presentation: Roma, Italy
  • Year and Date: 2017-10-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IMS-SET and RT-LAMP for sensitive detection of Cryptosporidium parvum oocysts in river water (2017)
  • Author(s): Sekikawa T.
  • Organizer: 10th Micropol & Ecohazard Conference 2017
  • Place of Presentation: Vienna, Austria
  • Year and Date: 2017-09-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A simple method for detecting Cryptosuporidium parvum oocysts in water resources by IMS-SET and LAMP (2017)
  • Author(s): Sekikawa T.
  • Organizer: 2nd International Resource Recovery Conference
  • Place of Presentation: New York, USA
  • Year and Date: 2017-08-05
  • Int'l Joint Research