天然ゴム生合成を包括的に制御する転写制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16K08138
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Research Field	Applied molecular and cellular biology
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	高橋征司東北大学, 工学研究科, 准教授 (90343061)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help	¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2018: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2017: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2016: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Keywords	天然ゴム / パラゴムノキ / イソプレノイド / ラテックス / 発現制御 / イソプレノイト
Outline of Annual Research Achievements	天然ゴムは合成ゴムでは完全代替不可能な優れた物性を示し、タイヤ等のゴム工業製品に不可欠な天然材料であるため、遺伝子工学的手法による天然ゴム生産能の増強が期待されている。現在、天然ゴムは、パラゴムノキの乳管細胞の細胞質に相当するラテックスより生産されている。これまでに研究代表者らは世界に先駆け天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の同定に成功している。それらは乳管細胞内で特異的に発現しているが、その転写制御機構に関する知見はほとんど得られていなかった。本計画では、天然ゴム生合成関連タンパク質のプロモーター領域に結合する転写因子の探索と、パラゴムノキ培養細胞系をプラットフォームとした機能評価系構築により、乳管細胞において天然ゴム生合成を包括的に制御する転写制御機構を解明する。 H28年度は、天然ゴム生合成関連タンパク質群の発現制御に寄与する転写因子の同定を行った。まず、ラテックスの平均化cDNAライブラリーを作製した。ラテックス特異的に発現する天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の5’上流プロモーター領域に対し結合しうる転写因子を単離するため、cDNAライブラリーをYeast one-hybrid system (Y1H)でスクリーニングし、1種類の推定転写因子が単離された。その全長cDNAを単離した後、パラゴムノキ各組織のtotal RNAを鋳型とした定量的Real-time RT-PCRを行った結果、ラテックス特異的に発現する転写因子であることが明らかとなった。また、候補転写因子が、各標的遺伝子の5’上流プロモーター領域のどの領域と相互作用するかを、Y1Hアッセイにより明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画の通りにスクリーニングを行い、目的とする性質を有する転写因子候補を取得することができた。また、予定されていた機能解析も行うことができた。
Strategy for Future Research Activity	H29年度は、H28年度に取得できた転写因子候補について、天然ゴム生合成制御における機能の解明を目的として、以下の4つの項目について研究を進める； (1)　レポーターアッセイによるシス配列同定：　パラゴムノキ葉肉細胞および培養細胞から調製したプロトプラストに、プロモーター領域のデリーションシリーズ及びそれらの部分変異配列をルシフェラーゼ遺伝子に連結したコンストラクトと転写因子の発現コンストラクトを導入し、転写因子結合領域に含まれるシス制御配列を明らかにする。 (2)　形質転換培養細胞の作製：　候補転写因子を、エストラジオール誘導型過剰発現が可能であるバイナリーベクターに導入し、それらで形質転換されたAgrobacteriumとパラゴムノキ培養細胞を共培養させ感染させた後に、バイナリーベクターが導入された形質転換カルスを選抜し、懸濁培養細胞化する。 (3)　形質転換培養細胞の遺伝子発現解析：　形質転換培養細胞をエストラジオール処理した後にtotal RNAを抽出し、定量的real-time RT-PCRにより候補転写因子の過剰発現を確認する。また、標的となる天然ゴム生合成関連遺伝子の発現レベルを解析し、転写因子過剰発現による効果を解析する。 (4)　天然ゴム生合成活性測定：　天然ゴム生合成関連タンパク質の発現上昇が確認された形質転換培養細胞より、粗タンパク質を調製し、それを用いてin vitroの天然ゴム生合成酵素アッセイを行う。
Expenditure Plan for Carryover Budget	H29年度計画において、実験系の開発が難しく試行回数が増えることが予想される、レポーターアッセイにH28年度の差額を適用する。