タンパク質の特異的ケミカルラベル化を利用した光-電子相関顕微鏡法の開発

• Project/Area Number: 16K14037
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Bio-related chemistry
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 田畑 栄一 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00538928)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2018: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: バイオテクノロジー / 分子イメージング / 電子顕微鏡イメージング / 蛋白質ラベル化 / 電子顕微鏡 / 蛍光顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

本申請課題の目的は、蛍光顕微鏡と透過型電子顕微鏡(TEM)を併用し、タンパク質複合体を超高解像度で可視化する手法の確立である。機能性分子を標的分子に対して選択的にラベル化する手法として、申請者のグループにおいて開発したリアクティブ・タグ法を採用した。本手法では、標的タンパク質に20残基程度のペプチドタグを導入し、これを特異的に認識する合成ケミカルプローブのペアにより、標的タンパク質選択的に、不可逆的な化学標識を達成する。
まずは蛍光標識、および金ナノ粒子による標識それぞれ単独でのラベル化を検討した。蛍光標識は、ラベル化に用いるケミカルプローブに蛍光色素Oregon Green 488を導入した化合物を用い、N末端にペプチドタグを融合したブラジキニン受容体B2Rをモデルタンパク質としてHEK293細胞に強制発現させて標識した。Cy5標識したアンタゴニストペプチドとの共染色で、蛍光のパターンがプローブと一致したことから、タグ特異的に蛍光標識できることが確認できた。
一方、TEM用のラベル化は、ビオチンを導入したプローブで標的分子をラベル化し、さらに1.4 nmの金ナノ粒子担持ストレプトアビジン(SA)で標識することで達成した。この検討では、タグペプチドをN末端、EGFPをC末端に融合したB2RをHEK293細胞に発現させ、ディッシュ上で細胞表層のB2Rをプローブ、そして金ナノ粒子担持SAでラベルしてから固定化処理し、加圧凍結してレプリカとした。これをさらに抗GFP抗体、そして10 nmの金ナノ粒子担持二次抗体で標識し、TEMで観察した。その結果、TEMで二種類の標識が観察され、タグ特異的に金属ナノ粒子による標識を達成できていることが示唆された。低分子合成プローブを用いて金属ナノ粒子により細胞表層のタンパク質を標識、そして電顕で可視化できた例はこれまで報告がなく、リアクティブ・タグ法が従来の免疫標識法に変わる手法として有用であることが示された。

Research Products

• [Int'l Joint Research] IST Austria(Austria)
• [Presentation] タンパク質特異的ラベル化を目指した新規タグ・プローブペアの開発 (2016)
  • Author(s): 渕田大和・田畑栄一・倉重信崇・浜地格・王子田彰夫
  • Organizer: 第28回 有機合成化学協会 九州山口支部 若手研究者のためのセミナー
  • Place of Presentation: 九州大学伊都キャンパス（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-08-27
  • Invited
• [Presentation] 第三世代ペプチドタグ/亜鉛錯体プローブペアによるタンパク質の特異的ラベル化 (2016)
  • Author(s): 倉重伸崇、渕田大和、田畑栄一、浜地格、王子田彰夫
  • Organizer: 第34回九州分析化学若手の会夏季セミナー
  • Place of Presentation: みるきーすぱサンビレッヂ（大分県日田市）
  • Year and Date: 2016-07-29
• [Presentation] 第三世代ペプチドタグ/亜鉛錯体プローブペアによるタンパク質の特異的ラベル化 (2016)
  • Author(s): 倉重伸崇、渕田大和、田畑栄一、浜地格、王子田彰夫
  • Organizer: 第53回化学関連支部合同九州大会および外国人研究者交流国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 北九州国際会議場（福岡県北九州市）
  • Year and Date: 2016-07-02
• [Presentation] タンパク質特異的ラベル化を目指した新規ペプチドタグ・亜鉛錯体プローブペアの開発 (2016)
  • Author(s): 渕田大和・田畑栄一・進藤直哉・高嶋一平・冷峭・初山勇次・浜地格・王子田彰夫
  • Organizer: 第26回万有福岡シンポジウム
  • Place of Presentation: 九州大学医学部百年講堂（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-04-23