| Project/Area Number |
16K14592
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Field |
Laboratory animal science
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
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| Research Collaborator |
UEMURA TAKESHI
MORI TAKUMA
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2018)
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| Budget Amount *help |
¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2017: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2016: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | ゲノム編集 / 子宮内エレクトロポレーション法 / シナプス / CRISPR/Cas9 / Rad51 / b-actin / 子宮内エレクトロポレーション / beta-アクチン / βアクチン / 動物実験技術 |
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| Outline of Final Research Achievements |
In order to develop a technology to knock-in genes into specific neurons in the brain, we attempted to insert the EGFP gene into the mouse β-actin gene. We injected a vector expressing Cas9 and sgRNA targeting the N-terminal end of β-actin, a donor vector containing 0.5 kb genome fragment of 5’ and 3 of the target region of β-actin as homology arms besides the EGFP sequence, and an RFP expression vector in the mouse lateral ventricle at embryonic day 15 and applied electric pulses. We detected EGFP signals consistent with the localization of β-actin protein in some population of neurons in the cerebral cortex. In addition, knock-in efficiency was increased up to 10-fold by extending the length of the homology arms of the donor vector and co-introduction of the Rad51 expression vector.
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| Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements |
CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集は、近年爆発的に研究されるようになってきてたが、これらの多くは培養細胞で行われており、in vivoでの研究は特に脳では少なかった。また、脳内の特定ニューロンへ遺伝子ノックインを行う研究は、本研究開始当初は皆無であった。本研究は、子宮内エレクトロポレーション法を用いるこよにより、大脳皮質の特定のニューロンに遺伝子ノックインを行うことが可能であることを証明した。加えて、ノックイン効率を高めるための方法についても提示した。本研究で開発した技術により、自閉症などの神経疾患で見つかった変異をニューロンに1世代で簡便に導入し、解析することが可能になった。
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