次世代型培養技術を駆使したびまん性星細胞腫モデル細胞の樹立

• Project/Area Number: 16K15641
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Neurosurgery
• Research Institution: Kumamoto University (2017); The University of Tokyo (2016)
• Principal Investigator: 武笠 晃丈 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (90463869)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2017: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 神経膠腫 / 星細胞腫 / IDH遺伝子 / 細胞モデル / 星細胞種

Outline of Annual Research Achievements

従来型の培養方法で樹立困難なIDH遺伝子変異を有する神経膠腫の細胞モデルを作成すべく研究に着手した。
前年度は、オルガノイド培養の検討を行い、通常の液体三次元培養可能な神経膠芽腫の腫瘍幹細胞株を、様々な 成長因子の組み合わせ下にてマトリゲル内で培養したが、この方法では増殖せず、むしろ従来の液体培地での浮遊培養の方の増殖が良かったため、グリア細胞には不向きである可能性が示唆された。さらに、正常アストロサイトに、IDH変異型の神経膠腫が一般に有する遺伝子異常を導入していくこととし、変異IDH1(R132H)遺伝子やhTERT、SV40の導入により、100継代以上経ても増殖を維持できる細胞を樹立し得たが、通常の低悪性度星細胞腫が有するようなATRX遺伝子の不活化した細胞は、途中でcrisis となり、その作成は困難であった。
H29年度は、さらに別なアプローチも考えつつ、モデル細胞の作成を継続した。その一つには、腫瘍手術切除検体からの初代培養によるIDH遺伝子変異陽性細胞の樹立であり、種々の悪性化過程にあるIDH変異のアストロサイトーマの腫瘍検体の培養を試みた。一定期間の培養は可能であるが、継代を続けると細胞増殖が困難となり樹立にいたらなかった。このため、初代培養細胞を一度iPS細胞化し、その後にこれを増殖させ、モデル細胞として用いることを計画する。そしてその前段階として、正常アストロサイトをiPS化する条件を確立することとし、エピソーマルベクターを用いて、iPS細胞誘導を行った。これによって、未分化なiPS様コロニーが取得できることが確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究は、過去に様々なグループが取り組むも樹立困難であったIDH遺伝子変異を有する神経膠腫細胞のモデル作成という困難な課題への挑戦である。モデル細胞の樹立は、我々にとっても容易でないが、もし樹立ができれば、特に低悪性度神経膠腫とその悪性転化における病態解明に非常に有用と考えられる。
オルガノイド培養系でのグリア系腫瘍の培養は、樹立困難であること示唆されたが、他のがん腫で試されている、種々の培養技術を引き続き検討する必要があると考えられた。代替として、hTERT導入を使用した方法で人のアストロサイトを不死化し、さらに変異型IDH遺伝子変異を導入したところ、IDH遺伝子変異陽性の神経膠腫細胞株を作成し得た。これに関しては、液体クロマトグラフィーを用いてIDH1 R132H変異に伴う代謝産物2-hydroxyglutarateの蓄積の検証や、マウス生体内での腫瘍形成能など、低悪性度神経膠腫モデル細胞としての性質について、引き続き検証を行っている。
IDH変異陽性神経膠腫切除検体からの、初代培養細胞の長期間の細胞継代が現在のところ困難であるため、これまでに確認したアストロサイトのiPS化技術を用いて、iPS細胞化を介した神経膠腫臨床検体からの腫瘍細胞株の樹立を目指して、技術改良を継続中である。

Strategy for Future Research Activity

上述したような、正常アストロサイトに遺伝子異常導入を行って作成したヒト低悪性度神経膠腫類似株の機能解析として、in vitro 及び in vivo での腫瘍形成能の評価を行うとともに、IDH R132H遺伝子変異に伴って生じるとされているゲノムワイドのDNAメチル化（Glioma CpG island methylator phenotype）や、ヒストン修飾などといったエピゲノム異常の、IDH遺伝子導入後の経時的変化を解析することで、IDH遺伝子変異によりもたらされる腫瘍化機構の病態と機序解明を行う。
同時に、さらに複数の方法による細胞株樹立を目指していく。一つの方法として、前述のように、IDH遺伝子変異陽性の神経膠腫症例の臨床検体から初代培養を行うが、直接の樹立でなく、上述のような iPS細胞化を介した腫瘍細胞モデル作成を目指すこととし、まずは、前段階の腫瘍細胞iPS株の樹立を目指す。これを得た後、分化誘導を行うことで、実験にもちいる低悪性度神経膠腫株を得る。また、この代替法として、手術検体を切り刻んで腫瘍細胞を採取した後に、直接ヌードマウスなどの免疫不全マウスへxenograftを作成することで、IDH変異陽性の神経膠腫株の樹立を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Identification of a novel fusion gene HMGA2-EGFR in glioblastoma. (2018)
  • Author(s): Komuro A, Raja E, Iwata C, Soda M, Isogaya K, Yuki K, Ino Y, Morikawa M, Todo T, Aburatani H, Suzuki H, Ranjit M, Natsume A, Mukasa A, Saito N, Okada H, Mano H, Miyazono K, Koinuma D.
  • Journal Title: Int J Cancer Volume: 142 Pages: 1627-1639
  • DOI: 10.1002/ijc.31179
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical significance of polyglutamylation in primary central nervous system lymphoma (2018)
  • Author(s): Shinojima Naoki、Fujimoto Kenji、Makino Keishi、Todaka Kohei、Yamada Kazumichi、Mikami Yoshiki、Oda Kazutaka、Nakamura Kazumi、Jono Hirofumi、Kuratsu Jun-ichi、Nakamura Hideo、Yano Shigetoshi、Mukasa Akitake
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Communications Volume: 6
  • DOI: 10.1186/s40478-018-0522-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 神経膠腫の不均一性による治療抵抗性とその治療戦略 (2018)
  • Author(s): 武笠 晃丈
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 36 Pages: 307-313
• [Journal Article] Genome-wide DNA methylation profiling identifies primary central nervous system lymphoma as a distinct entity different from systemic diffuse large B-cell lymphoma (2017)
  • Author(s): Nakamura T, Yamashita S, Fukumura K, Tanaka K, Nagane M, Narita Y, Mano H, Ushijima T, Ichimura K
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Volume: 133 Pages: 321-324
  • DOI: 10.1007/s00401-016-1664-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] An automated voxel-based method for calculating the reference value for a brain tumour metabolic index using 18F-FDG-PET and 11C-methionine PET (2017)
  • Author(s): Takahashi, Soma T, Mukasa A, Koyama, Arai T, Momose T.
  • Journal Title: Annals of Nuclear Medicine Volume: 31 Pages: 250-259
  • DOI: 10.1007/s12149-017-1153-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Differences in genetic and epigenetic alterations between von Hippel?Lindau disease?related and sporadic hemangioblastomas of the central nervous system (2017)
  • Author(s): Takayanagi S, Mukasa A, Tanaka S, Nomura M, Omata M, Yanagisawa S, Yamamoto S, Ichimura K, Nakatomi H, Ueki K, Aburatani H, Saito N
  • Journal Title: Neuro-Oncology Volume: 印刷中 Pages: 1228-1236
  • DOI: 10.1093/neuonc/nox034
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Brachyury gene copy number gain and activation of the PI3K/Akt pathway: association with upregulation of oncogenic Brachyury expression in skull base chordoma (2017)
  • Author(s): Otani Ryohei、Mukasa Akitake、Shin Masahiro、Omata Mayu、Takayanagi Shunsaku、Tanaka Shota、Ueki Keisuke、Saito Nobuhito
  • Journal Title: Journal of Neurosurgery Volume: なし Pages: 1-10
  • DOI: 10.3171/2016.12.jns161444
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Distinct molecular profile of diffuse cerebellar gliomas (2017)
  • Author(s): Nomura M, Mukasa A, Nagae G, Yamamoto S, Tatsuno K, Ueda H, Fukuda S, Umeda T, Suzuki T, Otani R, Kobayashi K, Maruyama T, Tanaka S, Takayanagi S, Nejo T, Takahashi S, Ichimura K, Nakamura T, Muragaki Y, Narita Y, Nagane M, Ueki K, Nishikawa R, Shibahara J, Aburatani H, Saito N
  • Journal Title: Acta Neuropathol. Volume: 134 Pages: 941-956
  • DOI: 10.1007/s00401-017-1771-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Spinal Cord Astrocytoma with Isocitrate Dehydrogenase 1 Gene Mutation (2017)
  • Author(s): Takai Keisuke、Tanaka Shota、Sota Takashi、Mukasa Akitake、Komori Takashi、Taniguchi Makoto
  • Journal Title: World Neurosurgery Volume: 108
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2017.08.142
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The significance of histone H3 K27M mutation in brain tumors (2017)
  • Author(s): 武笠 晃丈
  • Journal Title: Neuro-Oncologyの進歩 Volume: 24 Issue: 1 Pages: 7-17
  • DOI: 10.11452/neurooncology.24.1_7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Saito N. Genetic and epigenetic stability of oligodendrogliomas at recurrence. (2017)
  • Author(s): Aihara K, Mukasa A, Nagae G, Nomura M, Yamamoto S, Ueda H, Tatsuno K, Shibahara J, Takahashi M, Momose T, Tanaka S, Takayanagi S, Yanagisawa S, Nejo T, Takahashi S, Omata M, Otani R, Saito K, Narita Y, Nagane M, Nishikawa R, Ueki K, Aburatani H, Saito N
  • Journal Title: Acta Neuropathologica Communications Volume: 5 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1186/s40478-017-0422-z
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A combination of TERT promoter mutation and MGMT methylation status predicts clinically relevant subgroups of newly diagnosed glioblastomas (2016)
  • Author(s): Arita H, Yamasaki K, Matsushita Y, Nakamura T, Shimokawa A, Takami H, Tanaka S, Mukasa A, Shirahata M, Shimizu S, Suzuki K, Saito K, Kobayashi K, Higuchi F, Uzuka T, Otani R, Tamura K, Sumita K, Ohno M, Miyakita Y, Kagawa N, Hashimoto N, Hatae R, Yoshimoto K, Shinojima N, Nakamura H, Kanemura Y, Okita Y, et al.
  • Journal Title: Acta Neuropathol Commun Volume: 4 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1186/s40478-016-0351-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Diagnostic value of glutamate with 2-hydroxyglutarate in magnetic resonance spectroscopy for IDH1 mutant glioma. (2016)
  • Author(s): Nagashima H, Tanaka K, Sasayama T, Irino Y, Sato N, Takeuchi Y, Kyotani K, Mukasa A, Mizukawa K, Sakata J, Yamamoto Y, Hosoda K, Itoh T, Sasaki R, Kohmura E.
  • Journal Title: Neuro Oncol. Volume: 18(11) Pages: 1559-1568
  • DOI: 10.1093/neuonc/now090
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The characteristics of molecular profile changes in recurrent lower grade gliomas and their implication for therapeutic strategy (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa, Kuniaki Saito, Shota Tanaka, Shunsaku Takayanagi,Yoshitaka Narita, Motoo Nagane, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
  • Organizer: 5th Quadrennial Meeting of the World Federation of Neuro-Oncology Societies
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Spatial Heterogeneity of Molecular Profiles in Gliomas and its Implications for Cell-of-Origin and Targeted Therapy (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa
  • Organizer: The 72nd Fujihara Seminar
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Genetic and epigenetic stability of oligodendrogliomas at recurrence (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa, Koki Aihara, Masashi Nomura, Shota Tanaka, Junji Shibahara, Yoshitaka Narita, Motoo Nagane, Ryo Nishikawa, Keisuke Ueki, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
  • Organizer: The 14th Meeting of the Asian Society for Neuro-Oncology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Characteristic molecular profile changes in primary and recurrent gliomas depending on their histopathology (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa, Masashi Nomura, Kuniaki Saito, Koki Aihara, Genta Nagae, Takahide Nejo, Shota Tanaka, Shunsaku Takayanagi, Satoshi Takahashi, Mayu Omata, Taishi Nakamura, Yoshitaka Narita, Yoshihiro Muragaki, Motoo Nagane, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
  • Organizer: 22nd Annual Meeting of the Society of Neuro-Oncology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 再発 oligodendroglioma の ゲノム・エピゲノムの安定性 (2017)
  • Author(s): 武笠晃丈、相原功輝、野村昌志、田中將太、高柳俊作、永根基雄、成田善孝、植木敬介、油谷浩幸、斉藤延人
  • Organizer: 第34回日本脳腫瘍病理学会
• [Presentation] Integrated and comparative multi-omics analysis of primary and recurrent glioma and its clinical application (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa, Masashi Nomura, Kuniaki Saito, Koki Aihara, Genta Nagae, Takahide Nejo, Shunsaku Takayanagi, Shota Tanaka, Taishi Nakamura, Yoshitaka Narita, Yoshihiro Muragaki, Motoo Nagane, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
  • Organizer: 第76回日本脳神経外科学会
• [Presentation] 初発・再発神経膠腫のマルチオミクス比較解析から考える悪性転化機序とその治療戦略 (2017)
  • Author(s): 武笠晃丈、野村昌志、齊藤邦昭、相原功輝、永江玄太、上田 宏生、山本 尚吾、辰野 健二、根城 尭英、高橋 慧、高柳俊作、田中將太、花 大洵、北川陽介、中村大志、成田善孝、村垣善浩、永根基雄、西川 亮、植木敬介、油谷浩幸、斉藤延人
  • Organizer: 第35日本脳腫瘍学会
• [Presentation] The characteristics of molecular profile changes in recurrent lower grade gliomas and their implication for therapeutic strategy (2017)
  • Author(s): Akitake Mukasa
  • Organizer: The 8th Institute for Refractory Cancer Research (IRCR) International Symposium
  • Place of Presentation: Samsung medical center (Seoul, Korea)
  • Year and Date: 2017-01-13
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 遺伝子プロファイル解析から考える神経膠腫の診断と治療戦略 (2016)
  • Author(s): 武笠晃丈
  • Organizer: Temozolomide Forum in HIROSHIMA 2016
  • Place of Presentation: リーガロイヤルホテル広島（広島県・広島市）
  • Year and Date: 2016-12-13
  • Invited
• [Presentation] Molecular pathological analysis on IDH-wildtype adult low-grade gliomas (2016)
  • Author(s): Akitake Mukasa, Koki Aihara, Genta Nagae, Junji Shibahara, Shota Tanaka, Shunsaku Takayanagi, Masashi Nomura, Motoo Nagane, Yoshitaka Narita, Keisuke Ueki, Ryo Nishikawa, Hiroyuki Aburatani, Nobuhito Saito
  • Organizer: 21th Annual Meeting of the Society of Neuro-Oncology
  • Place of Presentation: Farimont Scottsdate Princess Hotel (Scottsdale, Arizona, USA)
  • Year and Date: 2016-11-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Influence of anticancer therapy on clonal evolution and intratumoral heterogeneity of gliomas (2016)
  • Author(s): Akitake Mukasa
  • Organizer: 75rd Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-08
  • Invited
• [Presentation] 再発神経膠腫の分子遺伝学的変化に基づく治療戦略の構築 (2016)
  • Author(s): 武笠晃丈、相原功輝、齊藤邦昭、永江玄太、野村昌志、根城 尭英、高柳俊作、田中將太、柳澤 俊介、高橋 慧、西川亮、永根基雄、成田善孝、植木敬介、油谷浩幸、斉藤延人
  • Organizer: 第75回日本脳神経外科学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県・福岡市）
  • Year and Date: 2016-09-30
• [Presentation] グリオーマのゲノム多様性とクローン進化に及ぼす抗がん治療の影響 (2016)
  • Author(s): 武笠晃丈
  • Organizer: 第21回脳腫瘍の外科学会
  • Place of Presentation: 虎ノ門ヒルズフォーラム（東京都・港区）
  • Year and Date: 2016-09-09
  • Invited
• [Book] 上衣系腫瘍, グリオーマ治療のDecision Making 脳神経外科診療プラクティス (2016)
  • Author(s): 武笠晃丈
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 文光堂
• [Book] 脳腫瘍の部位別発症頻度と問題点, 脳腫瘍学 日本臨床 2016年9月増刊号 (2016)
  • Author(s): 武笠晃丈、田中將太、斉藤延人
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 日本臨床社