心肥大で誘導される新規lincRNAの、筋組織における核内制御と核内機能の解明

• Project/Area Number: 16K19400
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Cardiovascular medicine
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 桑原 康秀 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (60632099)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2018: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 心不全 / 長鎖非コードRNA / 心肥大

Outline of Annual Research Achievements

我々はマウス心不全モデルを用いて、有意に転写されてくるタンパク質をコードしない新規長鎖非コードRNAを同定し、その心肥大における役割の解明を行っている。これまで何も転写産物が生じないと考えられていた遺伝子間領域から転写されてくるlong intergenic noncoding RNAであり、lincRNA-Hy5と名付けている。
二つの遺伝子の間から転写されてくるlincRNAであるため、独自のプロモーターを有することが予想された。そこで我々はプロモーターアッセイを行ったところ、心不全で重要な働きを行うSerum Response Factor（SRF)で転写活性が上昇することを見いだした。またlincRNA-Hy5の作用機序を解明するため、核内の結合タンパク質の同定を試みた。ビオチン化lincRNA-Hy5を作製し、肥大した心臓の核内タンパク質を結合させ、結合したタンパク質を質量分析で網羅的に同定したところ、非常に興味深いことに、最も特異的に結合するタンパク質は転写因子であった。またlincRNA-Hy5と、この転写因子との結合にlincRNA-Hy5のどの部位が重要であるかの同定にも成功した。
lincRNA-Hy5の生体での働きを解明するため、lincRNA-Hy5欠損マウスを作製し、その表現系を解析しているところである。８週令までの解析にとどまるが、普通に生存し、心機能も心エコー上は正常であった。ただし、心臓が少し小さい傾向にあり、また興味深いことに繊維化マーカーであるコラーゲンや、収縮タンパク質を構成するミオシン重鎖の遺伝子発現が有意に低下していた。現在はこのlincRNA-Hy5欠損マウスに圧負荷を加えることにより心不全を誘導した場合の心機能の評価を行っているところである。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の予定より非常にスムーズに進行している。lincRNA-Hy5の発現を制御する転写因子の同定や、その転写因子の結合部位の同定も終了した。また核内と細胞質におけるlincRNA-Hy5結合タンパク質の同定も終了している。
またlincRNA-Hy5欠損マウスの正常状態下での表現型解析は終了しており、圧負荷における解析もほぼ終了に近い状況である。以上のことから当初予定した以上に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

lincRNA-Hy5の圧負荷下での機能解析を行うために現在圧負荷を与えたlincRNA-Hy5の心臓を用いて、クロマチン免疫沈降等の実験を行っている。これが終了すれば論文投稿可能であると考えている。
lincRNA-Hy5は、心臓と骨格筋に特異的に発現するlincRNAであるため、心臓の解析が終了すれば、骨格筋における働きの解析を行う予定である。
またlincRNA-Hy5は心臓に保護的に働いているという結果が得られつつあるため、アデノ関連ウイルス９を用いて心臓特異的に過剰発現させ、心不全が改善するかを検討予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は次年度使用額も合わせて、消耗品やマウス飼育代に充てる予定である。

Research Products

• [Journal Article] Prevention of neointimal formation using miRNA-126-containing nanoparticle-conjugated stents in a rabbit model. (2017)
  • Author(s): Izuhara M, Kuwabara Y, Saito N, Yamamoto E, Hakuno D, Nakashima Y, Horie T, Baba O, Nishiga M, Nakao T, Nishino T, Nakazeki F, Ide Y, Kimura M, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12(3) Issue: 3 Pages: e0172798-e0172798
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0172798
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MicroRNA-33 Controls Adaptive Fibrotic Response in the Remodeling Heart by Preserving Lipid Raft Cholesterol. (2016)
  • Author(s): Nishiga M, Horie T, Kuwabara Y, Nagao K, Baba O, Nakao T, Nishino T, Hakuno D, Nakashima Y, Nishi H, Nakazeki F, Ide Y, Koyama S, Kimura M, Hanada R, Nakamura T, Inada T, Hasegawa K, Conway SJ, Kita T, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: Circ Res. Volume: - Issue: 5 Pages: 835-847
  • DOI: 10.1161/circresaha.116.309528
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] LincRNA Upregulated by Pressure Overload Induces Hypertrophy in Neonatal Mouse Cardiac Myocytes by Binding with Multiple Partners (2017)
  • Author(s): Kuwabara Y, Horie T, Watanabe S, Nishiga M, Baba O, Nakao T, Nishino T, Hakuno D, Nakashima Y, Nakazeki F, Ide Y, Koyama S, Kimura M, Hanada R, Kimura T, Ono K.
  • Organizer: 第81回 日本循環器学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂、金沢
  • Year and Date: 2017-03-17
• [Presentation] Overexpression of the LincRNA Regulated by Pressure-Overload Leads to Cardiomyocyte Hypertrophy (2016)
  • Author(s): 桑原康秀、堀江貴裕、馬場理、西賀雅隆、中尾哲史、西野共達、中関典子、小山智史、木村剛、尾野亘
  • Organizer: 第20回 日本心不全学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌、北海道
  • Year and Date: 2016-10-07
• [Presentation] ある循環器内科医の基礎研究と臨床 (2016)
  • Author(s): 桑原康秀
  • Organizer: 第14回 愛媛大学医学部 医科学研究発表会 特別講演
  • Place of Presentation: 東温、愛媛
  • Year and Date: 2016-09-20
  • Invited
• [Presentation] 筋肉特異的な新規長鎖非コードRNAは筋芽細胞分化を制御する (2016)
  • Author(s): 桑原康秀、堀江貴裕、馬場理、出原正康、宇佐美俊輔、中尾哲史、西賀雅隆、西野共達、井手裕也、中関典子、小山智史、木村剛、尾野亘
  • Organizer: Molecular Cardiovascular Conference II 2016
  • Place of Presentation: 東京ドームホテル、東京
  • Year and Date: 2016-09-02
• [Book] The Lipid (2017)
  • Author(s): 冠動脈疾患のリスクを下げる遺伝子バリアント
  • Total Pages: 2
  • Publisher: メディカルレビュー社
• [Remarks] 京都大学医学部附属病院 循環器内科
  • URL: http://kyoto-u-cardio.jp/kisokenkyu/metabolic/