中枢神経系細胞療法における安全対策の確立

• Project/Area Number: 16K19511
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Neurology
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 木村 康義 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50727451)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2018: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2017: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2016: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ゲノム安全領域 / 自殺遺伝子 / ヒト人工多能性幹細胞 / 細胞移植療法 / 再生医療 / ゲノム編集 / 神経疾患

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、①パーキンソン病などの神経難病への細胞移植療法における安全対策の検討・確立、および、②ヒト細胞に治療遺伝子を含む外来遺伝子を安全かつ安定的に組み込むための方法の検討・確立、を主たる目的として実施した。
最初にヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)へ、安全性を高め且つ安定的に機能する様に遺伝子を導入するためにゲノム上の安全領域候補の比較を行った。次に、ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を用いて、iPS細胞の安全領域候補の一つへ自殺遺伝子(HSV-tk)を組み込んだ。目的領域に遺伝子が正しく組み込まれていること、導入遺伝子が高レベルで発現していることを確認した。また、ゲノム編集に伴う明らかな標的外変異が無い事、導入操作後もiPS細胞が多能性を維持していることを確認した。さらに、in vitro(試験管内)でHSV-tkの作動薬であるガンシクロビルにより細胞死が誘導される事、初期分化後も安定的に導入遺伝子が発現し、機能を発揮する事を確認した。これらの結果に基づき、自殺遺伝子導入iPS細胞を免疫不全マウスに皮下接種し奇形腫を形成した上で、ガンシクロビルを皮下投与し、生体内でも有効に機能するかを検証した。一部の例では、腫瘍の著明な縮小効果を認めたが、無効例も存在した。以上から、生体内でHSV-tk自殺遺伝子システム単独では十分な安全対策とはならないことが示唆された。一方で、本研究で検証した安全領域に関する情報は、iPS細胞の遺伝子操作の際に有用であると考える(in preparation)。

Research Products

• [Presentation] An Extragenic Safe Harbor Permits Suicide Gene Expression Serving as a Safety Switch for Cell Therapy of Neurological Disorders (2016)
  • Author(s): Yasuyoshi Kimura, Yonehiro Kanemura, Tomoko Shofuda, Masafumi Onodera, Masaaki Oda, Masayuki Nakamori, Toru Nakano, Hideki Mochizuki
  • Organizer: 141st Annual Meeting of the American Neurological Association
  • Place of Presentation: ボルチモア、アメリカ
  • Year and Date: 2016-10-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Generation of human induced pluripotent stem cells carrying a safety switch for cell-based therapy in Parkinson’s disease (2016)
  • Author(s): Yasuyoshi Kimura, Yonehiro Kanemura, Tomoko Shofuda, Masafumi Onodera, Masaaki Oda, Masayuki Nakamori, Toru Nakano, Hideki Mochizuki
  • Organizer: 20th International Congress of Parkinson’s disease and Movement Disorders
  • Place of Presentation: ベルリン、ドイツ
  • Year and Date: 2016-06-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CRISPR/Cas9-mediated knock-in of a suicide gene in an extragenic safe harbor of iPSCs (2016)
  • Author(s): Yasuyoshi Kimura, Yonehiro Kanemura, Tomoko Shofuda, Masafumi Onodera, Masaaki Oda, Masayuki Nakamori, Toru Nakano, Hideki Mochizuki
  • Organizer: 第57回 日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2016-05-18