ラフトのコレステロールに結合するPFOタンパク質の構造遷移と相互作用様式の解明

• Project/Area Number: 17048009
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 片平 正人 横浜市立大学, 国際総合科学研究科, 教授 (70211844)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩下 淑子 財団法人東京都高齢者研究福祉振興財団, 東京都老人総合研究所, 副参事研究員 (50111498)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥6,400,000 (Direct Cost: ¥6,400,000); Fiscal Year 2006: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2005: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
• Keywords: ラフト / PFOタンパク質 / コレステロール / NMR / 構造 / リポソーム / イオンチャネル / 核酸 / 生体分子 / 生物物理 / 蛋白質 / 立体構造 / 膜

Research Abstract

PFOタンパク質を用いたラフトの細分化及び構造解析に向けた試料調製の改良
従来「ラフト画分」として用いられてきた界面活性剤に不溶性の低密度膜画分から、コレステロール含有率の高い膜サブセットを分離する手法を確立した。この手法を用いてJurkat細胞から分離したBC-PFO結合性のラフト膜サブセットには、フロチリン、ガングリオシドGM1等のラフトマーカー分子の他に、Lck, LAT, PAG等のT細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BC-PFO結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。
PFOタンパク質の構造及びコレステロール・脂質との相互作用様式の解析を、ドメイン4(D4)を用いて進行させた。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、これまでに100FMの濃度のD4試料を安定して調製できるようになっていた。今回さらに試料調製法の改良(凝集防止剤(本領域の群馬大学・若松先生よりご提供)の添加、リフォールディング・濃縮工程の修正、サンプル管のシリコン加工等)を行った結果、500μMの濃度のD4試料を得る事に成功した。タンパク質の安定性に関しても、調製されたタンパク質はこれまで数時間程度しか良好なスペクトルを与えなかったが、今回それを1週間程度まで伸ばす事に成功した。現在この試料を用いて3次元スペクトルの測定を行い、主鎖の帰属を進行させている。

Research Products

• [Journal Article] Structure of human telomeric DNA under physiological ionic conditions stabilized by proper incorporation of 8-bromoguanosines, as determined by NMR (2007)
  • Author(s): Matsugami, M他
  • Journal Title: FEBS J (印刷中)
• [Journal Article] Unichrom, a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs (2006)
  • Author(s): Tagashira, H他
  • Journal Title: Zoological Science 23 Pages: 9-21
• [Journal Article] Structural property of DNA that migrates faster in gel electrophoresis, as deduced by CD spectroscopy (2006)
  • Author(s): Matsugami, A他
  • Journal Title: Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 25 Pages: 417-425
• [Journal Article] Identification of 2-(cysteinyl) amido-2-deoxy-D-galacturonic acid residue from the sheath of Leptothrix cholodnii (2006)
  • Author(s): Makita, H他
  • Journal Title: Biosci. Biotech. ＆ Biochem 70 Pages: 1265-1268
• [Journal Article] Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures (2006)
  • Author(s): Nakagama, H他
  • Journal Title: Mutat. Res 598 Pages: 120-131
• [Journal Article] NMRによるタンパク質構造解析の展望 (2006)
  • Author(s): 宮ノ入洋平他
  • Journal Title: 酵素工学ニュース 55 Pages: 29-34
• [Journal Article] Structural analysis of DNA containing (6-4) photoproduct in complex with distamycin A by NMR (2006)
  • Author(s): Tsuchibayashi, H他
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp. Ser. 50 Pages: 237-238
• [Journal Article] The new models of the human telomere DNA in K^+ solution revealed by NMR analysis assisted by the incorporation of 8-bromoguanines (2006)
  • Author(s): Matsugami, A他
  • Journal Title: Nucleic Acids Symp. Ser 50 Pages: 42-43
• [Journal Article] a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs (2006)
  • Author(s): Tagashira, H., Shimotori, T., Sakamoto, N., Katahira, M., Miyanoiri, Y., Yamamoto, T., Mitsunaga-Nakatsubo, K., Kusunoki, S., Akasaka, K., Unichrom
  • Journal Title: Zoological science 23 Pages: 9-21
• [Journal Article] Structural property of DNA that migrates faster in gel electrophoresis, as deduced by CD spectroscopy, Nucleosides (2006)
  • Author(s): Matsugami, A., Tani, K., Ouhashi, K., Uesugi, S., Morita, M., Ohyama, T., katahira M.
  • Journal Title: Nucleotides and Nucleic Acids (in press)
• [Journal Article] Identification of 2-(cysteinyl)amido-2-deoxy-D-galacturonic acid residue from the sheath of Leptothrix cholodnii (2006)
  • Author(s): Makita, H., Nakahara, Y., Fukui, H., Miyanoiri, Y., Katahira, M., Seki, H., Takeda, M., Koizumi, J.
  • Journal Title: Biosci.Biotech.& Biochem (in press)
  • NAID: 10018531700
• [Journal Article] Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures (2006)
  • Author(s): Nakagama, H., Higuchi, K., Tanaka, E., Tsuchiya, N., Nakashima, K., Katahira, M., Fukuda, H.
  • Journal Title: Mutat.Res. (in press)
• [Journal Article] Structure of hnRNP D : single-stranded telomere DNA complex and unfolding of quadruplex by hnRNP D (2005)
  • Author(s): Enokizono, Y., Konishi, Y., Uesugi, S., Ishikawa, F., Katahira, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 18862-18870
• [Journal Article] H., Unfolding T higher DNA structures formed by the d(CGG) triplet repeat by UP1 protein (2005)
  • Author(s): Fukuda, H., Katahira, M., Tanaka, E., Enokizono, Y., Tsuchiya, N., Higuchi, K., Nagao, M., Nakagama
  • Journal Title: Genes Cells 10 Pages: 953-962
• [Journal Article] P.K.R., Human vault-associated non-coding RNAs bind to mitoxantrone, a chemotheraneutic compound (2005)
  • Author(s): Gopinath, S.C.B., Matsugami, A., Katahira.M., Kumar
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 33 Pages: 4874-4881
• [Journal Article] Structure of RNA aptamer complexed with an RNA-binding peptide of Tat with aid of residue-epecific ^<13>C, ^<15>N labeling (2005)
  • Author(s): Matsugami, A., Tochio, H., Niyada, E., Tamura, Y., Kudo, M., Misono, T., Kumar, P., Katahira, M.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res.Suppl. 5 Pages: 69-70
• [Journal Article] Separation of a cholesterol-enriched microdomain involved in T-cell signal transduction (2005)
  • Author(s): Shimada, Y., Inomata, M., Suzuki, H., Hayashi, M., Waheed, A.A., Ohno-Iwashita, Y.
  • Journal Title: FEBS J. 272 Pages: 5454-5463
• [Journal Article] Role for upregulated ganglioside biosynthesis and association of Src family kinases with microdomains in retinoic acid-induced differentiation of F9 embryonal carcinoma cells (2005)
  • Author(s): Sato, T., Zakaria, A.M., Uemura, S., Ishii, A., Ohno-Iwashita, Y., Igarashi, Y., Inokuchi.JI.
  • Journal Title: Glycobiology 15 Pages: 687-699
• [Journal Article] Structure an function of lipid rafts in human activated T cells' (2005)
  • Author(s): Tani-ichi, S., Maruyama, K., Kondo, N., Nagafuku, M., Kabayama, K., Inokuchi, J., Shimada, Y., Ohno-Iwashiita, Y., Yagita, H., Kawano, S., Kosugi, A.
  • Journal Title: International Immunology 17 Pages: 749-758
• [Journal Article] Adhesive surface determines raft composition in platelets adhered under flow (2005)
  • Author(s): van Lier, M., Lee, F., Farndale, R.W., Gorter, G., Verhoef, S., Ohno-Iwashita, Y., Akkerman, J.W.N., Heijnen, H.F.G
  • Journal Title: J.Thromb.Haemost 3 Pages: 2514-2525
• [Book] 生物物理学ハンドブック(分担) (2007)
  • Author(s): 片平正人
  • Publisher: 朝倉書店
• [Book] 第5版 実験化学講座8NMR・ESR(分担) (2006)
  • Author(s): 片平正人
  • Publisher: 丸善