核膜を介した双方向輸送に関わる蛋白質の多様な相互作用の構造生物学的研究

• Project/Area Number: 17048022
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山縣 ゆり子 熊本大学, 大学院医学薬学研究部, 教授 (40183678)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥6,700,000 (Direct Cost: ¥6,700,000); Fiscal Year 2006: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2005: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
• Keywords: RNA輸送 / 構造生物学 / 核膜輸送タンパク質 / タンパク質の結晶化 / タンパク質の大量発現

Research Abstract

熊本大学谷らによって酵母のmRNAの核外輸送ができない温度感受性株の一つの原因蛋白質として見出されたPtr7はATP/GTP結合モチーフをもつ酵母の生育に必須の新規蛋白質で、核膜を介した核と細胞質間の双方向の輸送に必須であることが示されている。本研究の目的は、この新たに見出されたPtr7のX線結晶構造解析を行い、核膜孔複合体因子の一部に見られ、輸送に関わる蛋白質と相互作用するFGリピート領域と同様の配列をもつ意味やヒトPtr7と相互作用すると考えられている幾つかの蛋白質との核膜を介したソフトな相互作用を解明することである。
昨年に引き続き、可溶性でより大量に得られる発現系の検討を行っている。昨年度発現ベクターはpBluescrpt系とpET系ベクターをもとに独自に作成したものを用い、大腸菌での発現、精製を試みたが、タグが無いため、うまく精製できなかった。本年度は、タグ(MBP、Trx、GSTなど)をつけた発現系の再構築を行った。融合蛋白質の発現は、特に、GST融合蛋白質について極めて高かったが、可溶性画分への移行が見られなかった。そこで、コールドショックベクターを用いた発現系を検討したところ、発現も、可溶性画分への移行も極めて良好であり、引き続き、TFタグを除くためのプロテアーゼ処理を行い、Ptr7蛋白質とTFタグの分離を試みた。いろいろなカラムクロマトグラフィーを行ったが、両蛋白質の分子量がほとんど同じであることも原因で、現在のところ、両蛋白質の分離に成功していない。そこで、融合蛋白質の状態で活性があるなら、融合蛋白質の結晶化を行うことを計画、現在、融合蛋白質のin vivoでの活性を調べている。

Research Products

• [Journal Article] Cromium (III) ion and thyroxine cooperate to stabilize the transthyretin tetramer and suppress in vitro amyloid fibril formation (2006)
  • Author(s): T.Sato et al.
  • Journal Title: FEBS Letters 580 Pages: 491-496
• [Journal Article] Probing inhibition, and crystallographic characterization of metallo-beta-lactamase (IMP-1) with fluorescent agents containing dansyl and thiol groups (2006)
  • Author(s): H.Kurosaki et al.
  • Journal Title: Chem. Med. Chem. 1 Pages: 969-972
• [Journal Article] Completely-buried, non-ion-paired glutamic acid contributes favorably to the conformational stability of pyrrolidone carboxyl peptidases from hyperthermophiles (2006)
  • Author(s): J.K.Kaushik et al.
  • Journal Title: Biochemistry 45 Pages: 7100-7112
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of human MTHI complexed with two oxidized nucleotides, 8-oxo-dGMP and 2-oxo-dATP (2006)
  • Author(s): T.Nakamura et al.
  • Journal Title: Acta Cryst. F62 Pages: 1283-1385
• [Journal Article] Identification of single Mn^<2+> binding sites required for activation of the mutant proteins of E.coli RNase HI at Glu48 and/or Asp 134 by X-ray crystallography (2005)
  • Author(s): Tsunaka, Y. et al.
  • Journal Title: J.Mol.Biol. 345 Pages: 1171-1183
• [Journal Article] Irreversible inhibition of metallo-β-lactamase (IMP-1) : by 3-(3-mercaptopropionyl-sulfanyl)propionic acid penta- fluorophenyl ester (2005)
  • Author(s): Kurosaki H. et al.
  • Journal Title: Angew Chem.Int.Ed. 44 Pages: 3861-3864
• [Journal Article] Probing the role of Asp120(81) of metallo-β-lactamase (IMP-1) by site-directed mutagenesis, kinetic studies, and X-ray crystallography (2005)
  • Author(s): Yamaguchi Y. et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 20824-29832
• [Journal Article] Mammalian enzymes for preventing transcriptional errors caused by oxidative damage (2005)
  • Author(s): Ishibashi T. et al.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. 33 Pages: 3779-3784
• [Journal Article] Conformational Changes in the Tryptophan Synthase from a Hyperthermophile upon α_2β_2 Complex Formation : Crystal Structure of the Complex (2005)
  • Author(s): Lee S.J.et al.
  • Journal Title: Biochemistry 44 Pages: 11417-11427
• [Book] タンパク質のかたちから生命のなぞを解く (2005)
  • Author(s): 田之倉優編
  • Total Pages: 232
  • Publisher: (株)クバクロ