単量体、2量体ウシチトクロム酸化酵素の構造と機能

• Project/Area Number: 17048028
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 伊藤 恭子 (新澤 恭子) 兵庫県立大学, 大学院生命理学研究科, 助手 (70206316)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2006: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2005: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: チトクロム酸化酵素 / X線結晶構造 / 機能単位 / リン脂質

Research Abstract

チトクロム酸化酵素は呼吸鎖の末端に位置し、チトクロムcから電子を受け取り、分子状酵素を水にまで還元すると共に、プロトンを膜の内側から外側へ能動輸送する。バクテリアから高等生物まで酸素を利用するあらゆる生物の生体エネルギー変換に最も重要な役割を果たす本酵素の反応機構を理解するためには、立体構造に関する情報が不可欠である。我々は、界面活性剤としてデシルマルトシド(C10M)を用いて精製、結晶化を行ない、酸化型で1.8ÅのX線結晶構造を明らかにした。
ウシ酵素では進化の過程で付加されたサブユニットを介してダイマーを形成したことからウシ酵素の機能単位は2量体であると考えられた。しかし、最近、新規合成した界面活性剤、3-オキサトリデシルマンノシド(30M)を用いた標品から得られた結晶中において酵素は単量体で存在していた。この結晶は、同じ精製バッチ内で得られた結晶間では、非常によい同型性を示したので4-7個のデータをマージングできたため、1.65Å分解能での解析が可能となった。また、酸化型結晶をアスコルビン酸、チトクロムcを含む緩衝液に浸せきし、還元型結晶を作成することに成功し、1.8Å分解能での解析が可能なデータの収集に成功した。この様に30Mから得られた結晶は、単量体の構造解析を可能にするだけでなく、C10Mに比べてより高い分解能で構造解析することを可能にした。
30M及びC10Mを用いた酵素に結合するリン量に差異は認められず、またリン脂質の種類も変化がなかった。そこで、まだ一部でではあるがx線結晶構造を解析したところサブユニット3に強固に結合するホスファチジルグリセロールの位置は変化が認められなかったがグイマー形成に重要な働きをしているカルジオリピンなど数個のリン脂質には大きな移動が認められた。

Research Products

• [Journal Article] A histidine residue acting as a controlling site for dioxygen reduction and proton pumping by cytochrome c oxidase (2007)
  • Author(s): Muramoto, K., Hirata, K., Shinzawa-Iton, K., Yoko-o, S., Yamashita, E., Aoyama, H., Tsukihara, T., Yoshikawa, S.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA (In press)
• [Journal Article] Resonance Raman spectra of the FMN of the bovine heart NADH : ubiquinone oxidoreductase, the largest membrane protein in the mitochondrial respiratorv system (2007)
  • Author(s): Sugiyama, H., Nakatsubo, R., Yamaguchi, S., Ogura, T., Shinzawa-Itoh, K., Yoshikawa, S.
  • Journal Title: J. Bioenergetics and Biomembranes (In press)
• [Journal Article] Structures and physiological roles of thirteen lipids of bovine heart cytochrome c oxidase (2007)
  • Author(s): Shinzawa-Itoh, K., Aoyama, H., Muramoto, K., Terada, H., Kurauchi, T., Tadehara, Y., Yamasaki, A., Sugimura, T., Kurono, S., Tsujimoto, K., Mizushima, T., Yamashita, E., Tsukihara, T., Yoshikawa, S.
  • Journal Title: EMBO J. 26 Pages: 1713-1725
• [Journal Article] Reaction mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase (2006)
  • Author(s): Yoshikawa, S., Muramoto, K., Shinzawa-Itoh, K., Aoyama, H., Tsukihara, T., Ogura, T., Shimokata, K., Katayama, Y., Shimada, H
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta 1757 Pages: 395-400
• [Journal Article] Proton pumping mechanism of bovine heart cytochrome c oxidase (2006)
  • Author(s): Yoshikawa, S., Muramoto, K., Shinzawa-Itoh, K., Aoyama, H., Tsukihara, T., Shimokata, K., Katayama, Y., Shimada, H.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta 1757 Pages: 1110-1116
• [Journal Article] Absolute configuration of the hydroxyfarnesylethyl group of haem A, determined by X-ray structural analysis of bovine heart cytochrome c oxidase using methods applicable at 2.8Å resolution (2005)
  • Author(s): Yamashita E., Aoyama H., Yao M., Muramoto K., Shinzawa-Itoh K., Yoshikawa S., Tsukihara T.
  • Journal Title: Acta Crystallographica section D D61 Pages: 1373-1377