電気化学的アフィニティー担体のプロテオミクス解析への適用

• Project/Area Number: 17651112
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied genomics
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 高橋 信弘 東京農工大学, 大学院共生科学技術研究院, 教授 (80293017)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 千葉 一裕 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 教授 (20227325)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2006: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2005: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: プロテオミクス / アフィニティー担体 / 蛋白質精製 / 蛋白質複合体 / 蛋白質相互作用

Research Abstract

本研究の目的は、アフィニティー担体のリガンドを固定するスペーサー部分に電気化学的に共有結合を切断できる化合物を導入し、生体内から特定の蛋白質複合体を特異的に回収するプロテオミクスの手法として確立することである。昨年度は、電気化学的に切断できるジチオアセタールにベンゾイル基を導入した化合物を基に、カルボキシル基側に各種のリガンドを結合できるカセット化合物を作製し、それにビオチンをリガンドとしてストレプトアビジンを結合させ通電で溶出できることを確認したが、アフィニティー担体への結合効率が予想より低かった。今年度は、リガンド間の間隙が小さいため分子量の大きいタンパク質の結合効率が低下すると考え、それを改善する目的で、カセット化合物に加え、リガンド間に間隙を導入するための化合物を混ぜて担体に固定化することを試みた。同時に、各種のタグ融合蛋白質を作製し、それらに対して結合する複合体を、細胞抽出液との混合、あるいは、培養細胞に導入・発現させた抽出液からのアフィニティー回収実験を行い、同じ各種タグ融合蛋白質を用いて既知の方法で単離した複合体試料について、プロテオミクス分析に適しているかどうか比較検討を行った。その結果、タンパク質の結合効率に改善が見られたが、通常の方法に較べて結合効率と言う点で十分ではなかった。さらに結合効率を上げるために、単位体積当たりの表面面積を大きくすることができる粒子状の担体に固定化することを試みたが、粒子間の通電が起こりにくいという問題があることが判明した。そこで、分子量の小さいペプチドに適用することで密に結合したリガンドを有効に利用できると考え、ペプチドを選択的に修飾するためのリガンドとしてプロリン残基に導入するための化合物を合成し、電気化学的に切断できるカセット化合物に組み込む段階まで進めプロテオミクスへの応用の基礎を確立することが出来た。

Research Products

• [Journal Article] Large-scale identification of N-linked glycoproteins using glycosylation site-specific stable isotope tagging and liquid chromatography-mass spectrometry (2007)
  • Author(s): Kaji H., Yamauchi Y, Takahashi N, Isobe T.
  • Journal Title: Nature Protocol (In press)
• [Journal Article] Hsp90 regulates the Fanconi anemia DNA damage response pathway (2007)
  • Author(s): Oda T, Hayano T, Miyaso H, Takahashi N, Yamashita T
  • Journal Title: Blood (In press)
• [Journal Article] TRIM11 binds to and destabilizes a key component of the activator-mediated cofactor complex (ARC105) through the ubiquitin Vproteasome system (2006)
  • Author(s): Ishikawa H, Tachikawa H, Miura Y, Takahashi N
  • Journal Title: FEBS Letters 580 Pages: 4784-4792
• [Journal Article] NOP132 is required for proper nucleolus localization of DEAD-box RNA helicase DDX47 (2006)
  • Author(s): Sekiguchi T, Hayano T, Yanagida M, Takahashi N, Nishimoto T
  • Journal Title: Nucleic Acids Research 34・16 Pages: 4593-4608
• [Journal Article] Potential roles for ubiquitin and the proteasome during ribosome biogenesis (2006)
  • Author(s): Stavreva, D.A.#, Kawasaki M.#, Dundr, M., Koberna, K., Mueller W.G., Tsujimura-Takahashi, T., Komatsu, W., Hayano, T., Isobe, T., Raska, I., Misteli, T., Takahashi, N., McNally, J.G., (# equally contributed, co-corresponding authors)
  • Journal Title: Mol. Cell. Biol. 26・13 Pages: 5131-5145
• [Book] Proteomic Biology using LC-MS (Takahashi N, Isobe T) (2007)
  • Author(s): Takahashi N.
  • Publisher: Wiley-Interscience, John Wiley ＆ Sons (In press)
• [Book] 分子間相互作用解析ハンドブック (2007)
  • Author(s): 高橋信弘, 藤山沙理, 千葉一裕
  • Publisher: 羊土社(印刷中)
• [Book] 遺伝子医学MOOK別冊・分子生物学実験シリーズ「図・写真で観る タンパク構造・機能解析実験 実践ガイド」(月原富武・新延道夫 編) (2005)
  • Author(s): 早野俊哉 他
  • Total Pages: 7
  • Publisher: メディカルドウ