生物時計装置作動の可視化

• Project/Area Number: 17657063
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Cell biology
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井原 邦夫 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助手 (90223297)
• Project Period (FY): 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2005: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
• Keywords: ナノバイオ / 分子モーター / 酵素反応 / 時計タンパク質 / タンパク質間相互作用 / X線結晶構造解析 / 原子構造 / 藍色細菌

Research Abstract

藍色細菌の生物時計分子装置は3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCから構成され、これまでにKaiA(我々による)とKaiCの原子構造がX線結晶構造解析により解明されている。我々は、別府温泉産の好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatusにおいて遺伝子移入系を確立し、生物発光リズム系を開発、さらに時計タンパク質と時計関連タンパク質の大腸菌における大量生産法と高度精製法を確立し、これらタンパク質の生化学的解析とX線結晶構造解析を進めてきた。
本実験計画では、未解明であったT.elongatus KaiBの結晶構造を解明した(Iwase et al.,2005,J.Biol.Chem.280:43141-43149)。KaiBは他のタンパク質との相同性も既知のモチーフも見つかっておらず、構造機能相関の推測が困難でした。我々はX線結晶構造解析により分解能2.6ÅでKaiBの4量体6角板状構造を解明し、その原子構造に基づき時計機能に重要なアミノ酸残基と「サブ構造」を実験的に同定した。in vivoリズム解析により、サブ構造である負電荷に富んだ2列の尾根状構造(negative ridges)とその間に存在する正電荷に富んだ溝状構造(positive cleft)が、時計発振に重要なことを明らかにした。KaiBサブユニット構造は新規フォールドであり、KaiBにおける構造機能相関の解明は世界初である。次にKaiA-KaiC聞の相互作用を一分子計測で解析するため、KaiC6量体をガラス基板に固定し、蛍光色素で修飾したKaiAを貫流して、相互作用を解析した。現在のところ、KaiAの非特異的吸着のノイズが高すぎて特異的なシグナルを検出するに至っていない。KaiAの非特異的吸着の軽減策の検討や溶液系での一分子計測系の立ち上げを試みつつある。

Research Products

• [Journal Article] Real-time monitoring of the circadian gene expression in the chloroplast. (2006)
  • Author(s): Matsuo, T., Onai, K., Okamoto, K., Minagawa, J., Ishiura, M.
  • Journal Title: Mol.Cell.Biol. 26 Pages: 863-870
• [Journal Article] Functionally important substructures of circadian clock protein KaiB in unique tetramer complex. (2005)
  • Author(s): Iwase, R., Imada, K., Hayashi, F., Uzumaki, T., Morishita, M., Onai, K., Furukawa, Y., Namba, K., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bio.Chem. 280 Pages: 43141-43149
• [Journal Article] PHYTOCLOCK1 encoding a novel GARP protein essential for the Arabidopsis circadain clock. (2005)
  • Author(s): Onai K, Ishiura M.
  • Journal Title: Genes Cells. 10 Pages: 963-972
• [Journal Article] A portable integrated automatic apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants. (2005)
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Furusawa, T., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant Cell Environ. 28 Pages: 1305-1315
• [Journal Article] Transcriptional regulation of the circadian clock operon kaiBC by upstream regions in cyanobacteria. (2005)
  • Author(s): Kutsuna S, Nakahira Y, Katayama M, Ishiura M, Kondo T.
  • Journal Title: Mol.Microbiol. 57 Pages: 1474-1484
• [Journal Article] Identification of novel clock-regulated genes by cDNA macroarray analysis in Chlamydomonas reinhardtii. (2005)
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tabata, S., Fukuzawa, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant Mol.Biol. 57 Pages: 889-906
• [Journal Article] An automated apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants. (2005)
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ezaki, N., Ofuchi, T., Ishiura, M.
  • Journal Title: Anal.Biochem. 340 Pages: 187-192
• [Journal Article] RAP, an integrated program for monitoring bioluminescence and analyzing circadian rhythms in real time. (2005)
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ishiura, M.
  • Journal Title: Anal.Biochem. 340 Pages: 193-200