低酸素反応因子HIF2αの新規抑制因子Int6の特異的RNAiによる人工血管新生

• Project/Area Number: 17659087
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General medical chemistry
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 芝崎 太 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (90300954)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 雄一郎 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (60349644) ; 内野 博之 東京医科大学, 八王子センター・麻酔科, 講師 (60266476) ; 砂田 芳秀 川崎医科大学, 神経内科, 教授 (00240713) ; 石川 雄一郎 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (92030070)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2006: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2005: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 血管新生 / HIF / 低酸素 / VEGF / siRNA / MMTV / Int6 / Two Hybrid / 低酸素反応性因子 / 閉塞性疾患 / 脳梗塞 / 心筋梗塞 / 翻訳調節因子

Research Abstract

低酸素ストレス応答に関与する遺伝子の中に転写因子HIF (hypoxia-inducible factor;低酸素反応性因子)が報告されている。この因子は、腫瘍の血管新生に必須であるVEGF(血管内皮細胞増殖因子)を作り出し、さらには、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関わる多くの解糖系酵素の転写制御を行うことが知られている。HIF自体はHIF1α、HIF2α、HIF3αの3種に大きく分かれ、通常の酸素濃度(21%)ではユビキチン・プロテアソームによって分解されているが、低酸素状態ではこの分解から免れて核内に移行することにより転写因子としてさまざまな因子の誘導を惹起する。
申請者芝崎らは、酵母Two Hybrid法を用いて、ヒトの心筋または脳のライブラリーから、HIF2αと相互作用を示す因子として新たにInt6を同定した。はもともと翻訳調節因子の1つであるeIF3e/p48であるが、マウス乳がん発症ウイルス(MMTV : Mouse Mammary Tumor Virus)がマウスに感染した際に9カ所の遺伝子座にintegrationされ、その箇所の標的遺伝子を破壊する。この破壊された遺伝子の6番目のintegrationサイトに当たることからInt6として命名された。MMTVの感染によりInt6はC末端の一部が欠損した、いわば恒常不活化型(dominant negative)変異体(Int6-ΔC)が生じ、乳がんを発症することが報告されている。詳細な検討の結果、Int6は直接HIF2αに結合し、ユビキチン・プロテアゾーム系を介して発現を抑制する調節因子であることが判明した。
さらにint6-siRNA発現ベクターを用いて、マウス皮下に導入したところ内因性のInt6の低下によるHIF2αの発現が上昇し、著明な正常血管新生が惹起された。これは、int6-siRNAが皮下の線維芽細胞に導入され、その細胞から動脈・静脈形成に必須な因子群を誘導した結果であり、その意味で、Int6/HIF2αは正常血管新生のマスタースイッチの1っであることが明らかになった。これらの結果から、合成int6-siRNAの内、内因性Int6の発現抑制に最も効果のある配列を再度検討し、最も効果のある配列を用いて、DNA/RNAキメラ法により合成したsiRNAを、ラット下肢閉塞モデルに投与したところ、著明な血管新生と症状の改善が認められた。現在、これらの結果により、アメリカFDAのPhase I Studyに入るべく準備を進めている。また、筋ジストロフィーや心筋梗塞、骨折、皮膚潰瘍などの治療目的でも開発を進めている。

Research Products

• [Journal Article] Mammalian Tumor Suppressor Int6 Specifically Targets HIF-2αTo Degradation by Hypoxia-And pVHL-Independent Regulation (2007)
  • Author(s): Li Chen, Kazuyo Uchida, Alexander Endler, Futoshi Shibasaki
  • Journal Title: J. Biol. Chem. (In press)
• [Journal Article] 外傷性脳損傷モデルにおける免疫抑制剤の脳保護効果とDNAマイクロアレイによる遺伝子の網羅的捕捉 (2007)
  • Author(s): 内野博之, 牛島一男, 池田幸穂, 諸田沙織, 石川雄一郎, 石井脩夫, 芝崎 太
  • Journal Title: 神経外傷 (In press)
  • NAID: 10031136342
• [Journal Article] The temporal profile of genomic responses and protein synthesis in ischemic tolerance of the rat brain induced by repeated hyperbaric oxygen. (2006)
  • Author(s): Hirata T, Cui YJ, Funakoshi T, Mizukami Y, Ishikawa YI, Shibasaki F, Matsumoto M, Sakabe T.
  • Journal Title: Brain Res. 1 Pages: 214-222
• [Journal Article] Effect of cyclosporin a on immediate early gene in rat global ischemia and its neuroprotection. (2006)
  • Author(s): Yamaguchi, T., Miyata, K., Shibasaki, F., Isshiki, A., Uchino, H.
  • Journal Title: J Pharmacol Sci 100 Pages: 73-81
  • NAID: 10018241202
• [Journal Article] A novel neuroprotective compound FR901459 with dual inhibition of calcineurin and cyclophilins. (2006)
  • Author(s): Uchino, H., Morota, S., Takahashi, T., Ikeda, Y., Kudo, Y., Ishii, N., Siesjo, B.K., Shibasaki.F
  • Journal Title: Acta Neurochir Suppl 96 Pages: 157-162
• [Journal Article] Search for novel gene markers of traumatic brain injury by time differential microarray analysis. (2006)
  • Author(s): Ishikawa, Y., Uchino, H., Morota, S., Li, C., Takahashi, T., Ikeda, Y., Ishii, N., Shibasaki, F.
  • Journal Title: Acta Neurochir Suppl 96 Pages: 163-167
• [Journal Article] Bcl-2 phosphorylation in the BH4 domain precedes caspase-3 activation and cell death after neonatal cerebral hypoxic-ischemic injury. (2006)
  • Author(s): Hallin, U., Kondo, E., Ozaki, Y., Hagberg, H., Shibasaki, F., Blomgren, K.
  • Journal Title: Neurobiol Dis 21 Pages: 478-486
• [Journal Article] 脳障害のメカニズム(総説) (2006)
  • Author(s): 内野博之, 諸田沙織, Li Chen, 高橋俊明, 工藤佳久, 池田幸穂, 石井郁夫, 芝崎 太
  • Journal Title: 蘇生 25 Pages: 1-11
• [Journal Article] 虚血性神経細胞死のメカニズム (2006)
  • Author(s): 内野博之, 諸田沙織, 牛島一男, Li Chen, 高橋俊明, 工藤佳久, 池田幸穂, 石井郁夫, 芝崎 太
  • Journal Title: 蘇生 25 Pages: 88-99
  • NAID: 10017644555
• [Journal Article] PP2/calcineurinの脱リン酸化能測定。タンパク質の翻訳後修飾解析プロトコール (2006)
  • Author(s): 石川雄一郎, 芝崎 太
  • Journal Title: 実験医学 別冊 Pages: 254-259
• [Journal Article] シクロスポリンの神経保護作用「免疫の進化-シクロスポリン20年の軌跡」 (2006)
  • Author(s): 芝崎 太, 内野博之
  • Journal Title: 医薬ジャーナル Pages: 256-263
• [Journal Article] プロテオミクス創薬の現状 (2006)
  • Author(s): 藤田芳司, 芝崎太, 内海潤
  • Journal Title: 分子呼吸器病 10 Pages: 102-110
• [Journal Article] 癌転移と血管新生特集「悪性腫瘍と骨」 (2006)
  • Author(s): 陳リー, 芝崎 太
  • Journal Title: Clinical Calcium 16 Pages: 81-87
• [Journal Article] A Novel Neuroprotective Compound FR901459 with Dual Inhibition of Calcineurin and Cyclophilins (2006)
  • Author(s): Uchino H, Morota S, Takahashi T, Chen Li, Ikeda Y, Kudo Y, Ishii N, Siesjo Bk, Shibasaki E
  • Journal Title: Acta Neurochir Sppl (in press.)
• [Journal Article] Search the Novel Genemakers for Traumatic Brain Injury by Time Differential Microarray Analysis. (2006)
  • Author(s): Yu-ichiro Ishikawa, Hiroyuki Uchino, Saori Morota, Chen Li, Toshiaki Takahashi, Yukio Iked, Nagao Ishii, Futoshi Shibasaki
  • Journal Title: Acta Neurochir Sppl (in press.)
• [Journal Article] 癌転移と血管新生 (2006)
  • Author(s): 芝崎 太
  • Journal Title: Clinical Calcium (In press)
• [Journal Article] 脳障害のメカニズム (2006)
  • Author(s): 内野博之, 諸田沙織, Chen Li, 高橋俊明, 工藤佳久, 石井脩夫, 芝崎 太
  • Journal Title: 蘇生 (In press)
  • NAID: 10017417823
• [Journal Article] 外傷性脳損傷モデルにおける免疫抑制剤の脳保護効果とDNAマイクロアレイによる遺伝子の網羅的捕捉 (2006)
  • Author(s): 内野博之, 牛島一男, 池田幸穂, 諸田沙織, 石川雄一郎, 石井脩夫, 芝崎 太
  • Journal Title: 神経外傷 (In press)
  • NAID: 10031136342
• [Journal Article] 脳蘇生における薬物療法 (2006)
  • Author(s): 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • Journal Title: 蘇生 (In press)
  • NAID: 10013501306
• [Journal Article] Effect of Cyclosporin A on Immediate Early Gene in rat global ischemia and its neuroprotection. (2005)
  • Author(s): Tatsuo Yamaguchi, Kazuto Miyata, Futoshi Shibasaki, Atushi Isshiki, Hiroyuki Uchino:
  • Journal Title: Journal of Pharmacological Science (in press.)
  • NAID: 10018241202
• [Journal Article] Expression of phosphorylated Ser70 of Bcl-2 correlates with malignancy in human colorectal neoplasms. (2005)
  • Author(s): Kondo, E., Miyake, T., Shibata, M., Kimura, T., Iwagaki, H., Nakamura, S., Tanaka, T., Ohara, N., Ichimura, k., Oka, T., Yanai, H., Shibasaki, F., Yoshino, T.
  • Journal Title: Clin Cancer Res 11 Pages: 7255-7263
• [Journal Article] Calcium signal-induced cofilin dephosphorylation is mediated by Slingshot via calcineurin (2005)
  • Author(s): Wang, Y., Shibasaki, F., Mizuno, K
  • Journal Title: J Biol Chem 280 Pages: 12683-12689
• [Journal Article] Calcineurin inhibits Na^+/Ca^<2+> exchange in phenylephrine-treated hypertrophic cardiomyocytes (2005)
  • Author(s): Katanosaka Y., Iwata, Y., Kobayashi, Y., Shibasaki, F., Wakabayashi, S., Shigekawa, M
  • Journal Title: J Biol Chem 280 Pages: 5764-5772
• [Journal Article] Galpha12/13-mediated production of reactive oxygen species is critical for angiotensin receptor-induced NFAT activation in cardiac fibroblasts (2005)
  • Author(s): Fujii T., Onohara, N., Maruyama, Y., Tanabe, S., Kobayashi, H., Fukutomi, M., Nagamatsu, Y., Nishihara, N., Inoue, R., Sumimoto, H., Shibasaki, F., et al.
  • Journal Title: J Biol Chem 280 Pages: 23041-23047
• [Journal Article] Bcl-2 phosphorylation in the domain precedes caspas-3 activation and cell death after neonatal cerebral hypoxic-ischemic injury. (2005)
  • Author(s): Hallin U, Kondo E, Ozaki Y, Hagberg H, Shibasaki F, Blomgren K.
  • Journal Title: Neurobiol Dis. 21 Pages: 478-486
• [Journal Article] Potent neuroprotection of CsA by inhibiting pathways involving calcinenurn and cyclophilin D in forebrain ischemia (2005)
  • Author(s): Shibasaki, F, Uchino, H., Kristian, T., Perkins, G., Ishii, N., Siesjo, B.K.:
  • Journal Title: Pharmacology of Cerebral Ischemia Pages: 453-465
• [Journal Article] T細胞を介した免疫寛容の制御機構 (2005)
  • Author(s): 芝崎 太
  • Journal Title: 臨床免疫学 63 Pages: 407-413
• [Journal Article] CsAの神経保護作用 免疫の進化 (2005)
  • Author(s): 芝崎 太, 内野博之
  • Journal Title: 医薬ジャーナル Pages: 256-263