リアル-タイムPCRを応用したVHL遺伝子診断法の新規開発

Research Project

Project/Area Number	17659508
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Urology
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	寺西淳一横浜市立大学, 附属病院, 助手 (70336551)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	矢尾正祐横浜市立大学, 医学研究科, 準教授 (00260787) 岸田健横浜市立大学, 附属病院, 準教授 (60254166) 岸田健横浜市立大学, 大学病院, 準教授 (14571511)
Project Period (FY)	2005 – 2006
Project Status	Completed (Fiscal Year 2006)
Budget Amount *help	¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000) Fiscal Year 2006: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000) Fiscal Year 2005: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	VHL病 / 遺伝子診断 / 欠失変異 / リアルタイムPCR
Research Abstract	Von Hippel-Lindau病(VHL)は中枢神経血管芽腫、網膜血管腫、淡明細胞腎癌、褐色細胞腫等を好発する遺伝性の腫瘍症候群で、ヒト染色体3番短腕に存在するVHLがん抑制遺伝子の胚細胞変異により発症することが知られている。VHL遺伝子が1993年に単離された後、遺伝子変異の検出に基づく家系の遺伝子診断が広く行われ標準的な診断法の一つとして普及しつつある。これまでVHL家系の遺伝子内変異は約70%の家系に検出されるが、残りの約30%はシークエンス法では検出不可能な比較的大きなゲノム欠失を持つと考えられている。これらの変異検出には、現在定量的サザン法が標準法として用いられることが多いが、RIを使うことや検査の煩雑性があり一般的にはあまり普及していない。そこでこの問題点を解決すべく、我々はVHL遺伝子内変異が検出できない家系で、定量的リアルタイムPCR法を応用した遺伝子欠失の新規検出法を考案、開発した。対象・方法:シークエンス解析で遺伝子内変異がない本邦のVHL26家系・36検体(type1:22家系、type2A:3家系、type2B:1家系)、正常および久夫の明らかなコントロール群30、10検体ずつ。VHL遺伝子Exon1〜3,5'promotorと3'UTR領域に対応するprimerとinternal controlとしてalbuminのprimerを作成し、TaqMan probeを用いて定量的リアルタイムPCR法を施行し、各Exonとalbuminのシグナルを比較することでVHL遺伝子の量的変化をみた。遺伝子解析のICは金側取得済みである。結果:VHL遺伝子内に複数のTaqMan primer/probeを設計、これらのPCRの条件を様々に検討後、検出に最適な条件設定をcontorolサンプル群で決定した。この条件下で、26家系中24家系(type1:21家系、type2A:2家系、type2B:1家系)に遺伝子欠夫を確認することができた。考察:本方法は微量のDNA検体から簡便、迅速にVHL遺伝子欠夫の検出が可能であり、現在標準法と考えられる定量的サザン法に今後置き換わる新規診断法になるものと考えられた。