ソノポレーション法によるinvivoコルチ器へのprestin遺伝子導入

• Project/Area Number: 17659525
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Otorhinolaryngology
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 欠畑 誠治 弘前大学, 医学部, 助教授 (90261619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸屋 信一郎 弘前大学, 医学部附属病院, 助手 (90396408) ; 和田 仁 東北大学, 大学院工学研究科, 教授 (30111264)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2006: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2005: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: ソノポレーション法 / コルチ器 / 外有毛細胞 / prestin

Research Abstract

目的:これまでのprestinを発現させた実験は、ポリフェクッション法にてCHO-K1やkidney cell lineなどの培養細胞に形質導入を行っている。ソノポレーション法は生体への影響やダメージが少なく、組織内に電極を進入させずに非侵襲的に目的部位に遺伝子導入が可能である。本研究ではコルチ器内の細胞に直接prestin遺伝子Presの形質導入を行い、prestinの発現を確認した。
結果:
1.Prestin遺伝子のコルチ器内感覚細胞・支持細胞への形質導入技術の確立
gerbilより同定したprestin遺伝子(Pres)を、マイクロバブル(診断用超音波造影剤)を併用してソノポレーション法にて内耳に導入した。生後5日目(P5)から生後18日目(Pl8)までのC57BL/6Jマウスの頂回転より蝸牛を取り出した。prestin遺伝子とマイクロバブルを混和した後、混和した細胞外液に蝸牛を入れ超音波を照射した。
2.蛍光顕微鏡・レーザー顕微鏡によるコルチ器内prestin発現細胞の形態学的解析
prestin遺伝子の導入は、発現ベクターにGFP遺伝子を挿入しGFPによる蛍光シグナルをソノポレーションによる導入24-48時間後に確認した。蛍光顕微鏡・レーザー顕微鏡を用いて、prestin遺伝子導入細胞のコルチ器内のGFPの蛍光シグナルを確認したところ、三列の外有毛細胞、一列の内有毛細胞そして支持細胞の列に一致してGFPの蛍光が認められた。
3.RT-PCR法によるprestin発現の解析
ソノポレーションによる導入24-48時間後にコルチ器組織よりRNAを抽出し、gerbilのprestin遺伝子配列に特異的なオリゴプライマーを用い、reverse transcription-PCRによって導入prestinの発現を確認した。