膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

• Project/Area Number: 17681026
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Living organism molecular science
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 永田 宏次 東京大学, 大学院農学生命科学研究, 助教授 (30280788)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥30,550,000 (Direct Cost: ¥23,500,000、Indirect Cost: ¥7,050,000); Fiscal Year 2006: ¥10,270,000 (Direct Cost: ¥7,900,000、Indirect Cost: ¥2,370,000); Fiscal Year 2005: ¥20,280,000 (Direct Cost: ¥15,600,000、Indirect Cost: ¥4,680,000)
• Keywords: membrane protein / Thermus thermophilus / Aeropyrum pernix / high-throughput expression / structural genomics

Research Abstract

平成18年度は、平成17年度に引き続き原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討する一方で、新たに真核生物の膜タンパク質を酵母を宿主として発現させる系について検討した。原核生物の膜タンパク質については、好熱細菌Thermus thermophilusと好熱古細菌Aeropyrum pernix岳の膜タンパク質、各53個、計106個について、pBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込むことを計画したが、一部の膜タンパク質遺伝子のベクターへの導入に難航し、結局pBADベクターに27個の膜タンパク質遺伝子を組み込み、その発現確認実験を行った。その結果、Flagタグ抗体を用いたWestern blotで、27個のうち15個の膜タンパク質について発現が確認された。特に、複数の輸送体膜タンパク質の発現量が非常に高いことが示され、結晶化用試料の調製が可能になった。真核生物の膜タンパク質については、ヒト、カイコガ、線虫、シロイヌナズナ、酵母の膜タンパク質、約50個を対象とした。膜タンパク質発現量の確認を効率のよく行うため、[α-mating factorのシグナル配列]-[膜タンパク質]-[GFP]を酵母S.cerevisiaeで発現させるベクターを構築した。現在、上記真核生物の膜タンパク質の発現確認を進めている。

Research Products

• [Journal Article] Solution structure and binding specificity of FBPII/HYPA WW domain as Group-II/III. (2006)
  • Author(s): Kato, Y., Hino, Y., Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proteins 63 Pages: 227-234
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the C-terminal RNase III domain of human Dicer. (2006)
  • Author(s): Takeshita, D., Zenno, S., Lee, W.C., Nagata, K., Saigo, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F62 Pages: 402-404
• [Journal Article] Crystal structures of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7 in its three states [NAD (P)^+-free, NAD^+-bound, and NADP^+-bound]. (2006)
  • Author(s): Okai, M., Kudo, N., Lee, W.C., Kamo, M., Nagata K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Biochemistry 45 Pages: 5103-5110
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of CTP : phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) from Saccharomyces cerevlslae. (2006)
  • Author(s): Ohtsuta J., Nagata, K., Lee, W.C., Ono, Y., Fukuda, R., Ohta, A., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F62 Pages: 1003-1005
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of human S100A13. (2006)
  • Author(s): Imai F.L., Nagata, K., Yonezawa, N., Yu, J., Ito, E., Kanai, S., Tanokura, M., Nakano.M.
  • Journal Title: Acta Crystallogr. F62 Pages: 1144-1146
• [Journal Article] Siamycin attenuates fsr quorum sensing mediated by gelatinase biosynthesis-activating pheromone in Enterococcus faecalis. (2006)
  • Author(s): Nakayama, J., Tanaka, E., Kariyama, R., Nagata, K.(5名), Sonomoto, K.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 189 Pages: 1358-1365
• [Journal Article] Crystal Structure Of the YjgF/YER057c/UK114 Family protein from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii strain 7. (2006)
  • Author(s): Miyakawa, T., (5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proteins 62 Pages: 557-561
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of PHI566, a putative ribosomal RNA processing factor from the hyperthermophilic archacon Pyrococcus horikoshii OT3. (2006)
  • Author(s): Jia, M.Z., Ohtsuka, J., Lee, W.C., Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 62 Pages: 47-48
• [Journal Article] Crystal structure of monomeric sarcosine oxidase from Bacillus sp. NS-129 revcals multiple conformations at the active-site loop. (2005)
  • Author(s): Nagata, K et al.(計11名)
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 220-224
• [Journal Article] Crystal structure of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7. (2005)
  • Author(s): Okai, M., Kudo, N., Nagata, K., Lee, W.C., Kamo, M., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 229-232
  • NAID: 130000093802
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the YjgF/YER057c/UK114-family protein ST0811 from Sulfolobus tokodaii strain7. (2005)
  • Author(s): Miyakawa, T.(5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 61 Pages: 828-830
• [Journal Article] Crystal structure of glutamine amidotransferase from Pyrococcus horikoshii OT3. (2005)
  • Author(s): Maruoka, S., Lee, W.C., Kamo, M., Kudo, N., Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 459-462
  • NAID: 130000093819