| Project/Area Number |
17700347
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Neurochemistry/Neuropharmacology
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
増田 章男 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助手 (10343203)
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| Project Period (FY) |
2005 – 2006
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2006)
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| Budget Amount *help |
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2006: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2005: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | スプライシング / PTBP1 / HnRNP-H / 筋無力症 / AChR / MS2 / 遺伝子 / RNA / 神経科学 |
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| Research Abstract |
AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行った。
P3Aのalternative splicingを生じるαIVS3-8G→A mutationを解析した。
変異配列とその前後15merを含んだoligo DNA(計31mer)およびその対象として同一部位の正常配列より、in vitro transcription法によりBiotin標識したUTPを取り込ませながらprobe RNAを合成した。HEK293細胞より抽出した核タンパクとprobeを混合し、probeと核タンパクを結合させた。このRNA/蛋白複合体をstreptavidineビーズにより精製し、結合蛋白をWestern blotting法により同定したところ、probeには、スプライシング制御因子であるPTBP1とHnRNP-Hが結合することが判明した。特に、HnRNP-Hは変異配列で結合が著明に減弱していた。
次に、HnRNP-Hと特定の配列RNAに結合することが知られているMS2coat proteinの融合タンパク(MS2-HnRNP-H)発現プラスミドを作成した。変異部位にMS2結合配列を挿入したminigeneを作成し、Hela細胞にMS2-HnRNP-H発現プラスミドと共にtransfectionした。RNAを回収し、P3Aのスプライスパターンの変化を確認したところ、MS2-HnRNP-H発現によりP3A exon inclusionが著明に減少した。
以上により、αIVS3-8G→Amutationは、HnRNP-H結合部位を破壊し、HnRNP-Hが機能しなくなるため、alternativesplicingを引き起こすことが判明した。
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